이 프로토콜은 우리가 우리가 비용 효과적인 방식으로 유전자 변형 동물을 활용시키는 후두 리팔가르드 협착의 작은 동물 모델에서 약물 용출 스텐트를 조사 할 수 있습니다. 약물 용출기도 스텐트의 경구 배치는 후두림 협착증의 임상적으로 관련된 모델을 나타내는 기관으로 열린 절개에서 동물을 절약. 이 기술은 후두를 취급하기 위하여 현지 약 납품 전략의 전임상 조사를 용이하게 합니다.
이 기술은 더 큰 동물 모델뿐만 아니라 임상 응용 프로그램에서 향후 조사를 신청할 수있는 작은 동물 모델에서 약물 용출기도 스텐트의 번역 조사를위한 실현 가능하고 효과적인 플랫폼을 제공합니다. 특히 뇌관, 기관 손상 유도 및 기도 스텐트 배치 단계. 기술적으로 도전적인 이 수술의 시각적 데모는 많은 미세 한 세부 사항이 단어로 완전히 설명 될 수 없기 때문에 중요합니다.
폴리머 용액을 함유한 1%라파마이신을 만들려면 6밀리그램의 라파마이신을 유리 바이알에 70-30 PLLA-PCL의 600밀리그램에 추가합니다. 연기 후드 아래에 는 라파마이신에 디클로로메탄 6밀리리터를 넣고 바이알을 조절하고 각 유리병에 120 마이크로리터의 글리세롤을 추가합니다. 그런 다음 바이알을 캡하고 PLLA-PCL 용액이 실온에서 6~12시간 동안 균질화되도록 합니다.
멸균 재료와 기술을 사용하여 뮤린 기도 스텐트를 만들려면 카테터를 느리게하면서 22 게이지 불소 에틸렌 프로필렌 기반 협안회체의 정맥 캐뉼라에 라파마이신 보충제 PLLA-PCL 용액 1밀리리터를 적용합니다. 모든 솔루션이 적용되면, 진공 후드에 유리 페트리 접시의 가장자리에 카테터의 끝에 있는 성형 된 협경골테터를 소품. 실온에서 진공 상태에서 24 시간 후, 부드럽게 비틀고 건조 된 스텐트 구조에서 카테터를 밀어 주조 과정에서 발생할 수있는 결함이 있는지 스텐트를 검사합니다.
시각화를 돕기 위해 스텐트의 길이 아래로 얇은 검은 선을 그리는 것이 도움이됩니다. 주조된 스텐트의 각 끝을 미세한 직선 가위로 트리밍하여 가장자리가 축축되도록 하고 가위를 사용하여 각 스텐트를 3mm 축 세그먼트로 자른다. 그런 다음 3밀리미터 스텐트를 새로운 22 게이지 정맥 카테터에 로드합니다.
후두 협착증 유도의 경우 발가락 핀치에 대한 반응이 없음을 확인한 후 첫 번째 마우스를 척추 위치에 있는 수술 플랫폼에 배치하고 중앙 절개 주위플랫폼 상단에 부착된 작은 실조각을 반복합니다. 테이프로 테이블에 팔다리를 고정하고 마우스 목에 1.5 센티미터 중간 선 수직 절개를합니다. 지나치게 되는 흉구를 나누고 두 개의 결과된 엽을 측면화하여 기관진을 시각화합니다.
오버리 스테노하이드와 스테르노갑 근육을 우수한 부착에 간질적으로 나누고 후두를 통해 트랜스오시카테터를 기관으로 전달합니다. 작은 집게를 사용하여, 카테터의 올바른 배치를 돕기 위해 마우스의 전방 후두에 압력을 가하십시오. 올바르게 배치된 협경골은 기관을 통해 흰색으로 시각화할 수 있습니다.
부상을 유도하기 위해 삽입된 협막심을 통해 Bleomycin 코팅 와이어 브러시를 전달하고 카테터를 천천히 철회하여 와이어 브러시만 기관 내에 유지되도록 합니다. 미세 한 집게를 사용 하 여, 기계적 브러시와 기관 루멘을 방해 하는 기관체에 카운터 압력을 적용 하 고 브러시 위에 기관으로 카테터를 다시 삽입 합니다. 와이어 브러시를 제거하고 Bleomycin을 다시 바르고 브러시를 4번 더 삽입하고 제거합니다.
마지막 Bleomycin 응용 프로그램 후, 기관에서 카테터를 제거합니다. PLLA-PCL의 경구 배치의 경우 얇은 검은색 세로 선이 각 스텐트에 통합되었는지 확인하고 미리 로드된 협안토테터로 마우스를 트랜스터로 삽관합니다. 스텐트는 경부 절개를 통해 기관 내에서 시각화되어야합니다.
스텐트가 제자리에 있을 때, 절개를 통해 기관지를 단단히 단단히 잡지만 부드럽게 잡아 스텐트를 제자리에 고정하고 카테터를 제거하려면 미세 한 집게를 사용합니다. 스텐트를 가능한 한 신중하게 배치하는 것이 중요합니다. 기관에 너무 많은 압력은 동물에 기도 방해와 죽음을 일으키는 스텐트의 붕괴귀착될 것입니다.
여기에 사용되는 조직 접착제 또는 흡수 가능한 4-0 색색 봉합사로 절개를 닫고 마우스가 동물을 홈 케이지로 되돌리기 전에 모니터링을 통해 복구 할 수 있습니다. 적절한 실험 적 끝점에서, 수술 플랫폼에 supine 위치에 관심있는 마우스를 배치하고 절개를 다시 열 미세 곡선 홍채 가위를 사용합니다. 기관체를 입증된 대로 노출시키고 가위를 사용하여 스텐트 수준 이하로 탈구 기관을 나눕니다.
다음으로, 근위 기관체를 후두 아래와 스텐트 위에 나누고 분할된 기관체를 식도로부터 후방으로 분리한다. 그런 다음 기관에서 스텐트를 제거하고 24 시간 동안 10 %의 포르말린으로 기관을 수정합니다. 이 연구에서 사용되는 생분해성 라파마이신로드 PLLA-PCL 스텐트 구조는 생리학적 조건하에서 일관되고 예측 가능한 방식으로 라파마이신을 용연할 수 있습니다.
본 이미지에서, 소형생체적합성 스텐트는 반투명 마우스 기관을 통해 시각화된 스텐트상 검정 마커에 의해 표시된 바와 같이 기관 내의 좌막에서 관찰될 수 있다. 21일 후, 검은 염료 마커를 사용하여 기관 내의 스텐트 위치의 유지를 확인할 수 있다. 급성 및 만성 염증의 마커에 대한 면역 형광 염색을 이용한 생체 적합성 테스트는 PLLA-PCL 스텐트 구조가 부상이 없는 경우 배치 후 존재하는 면역 세포의 최소 수에 의해 결정된 바와 같이 면역 반응성이 없음을 보여줍니다.
섬세하고 외상적인 방식으로 기도를 조작하는 것은 절차의 성공에 매우 중요합니다. 과도한 힘, 여러 삽관 및 스텐트가 붕괴되면 동물의 사망이 발생할 수 있습니다. 라파마이신-용출 스텐트, 생존 평가, 정량적 실시간 PCR을 통한 유전자 발현, 유동 세포측정, ELISA 및 면역작용화학을 포함한 면역분석작용을 통해 치료한 후 수행될 수 있다.
마우스 모델에서 약물 용출을 위한 성공적인 플랫폼을 제공하므로, 이 기술은 후두리가르드 협착증에서 국소 적용 된 치료법에 대한 향후 조사를위한 길을 열어줍니다. 디클로로메탄은 부식성 액체입니다. 항상 연기 후드, 개인 보호 장비 및 비 부식성 재료를 사용해야 합니다.
