조직 으로 설계된 기관의 임상 응용 은 접목 협착증 및 지연 된 상피화로 인해 제한되었습니다. 직교 학장 교체의 마우스 모델은 재생을 구동 하는 세포 메커니즘의 연구를 허용. 기도의 긴 세그먼트 결점은 현재 치료가 치료할 수 있는 무슨을 초과할 수 있습니다.
조직 으로 설계된 기관체는 이러한 조건에 대 한 대체 기관을 만들 수 있는 잠재력을 제공 합니다. 이 모델은 형질전환 및 계보 추적 특성을 가진 동물에게 적용할 수 있습니다. 그런 다음 접목 재생에 기여하는 호스트 요인을 조절할 수 있습니다.
스캐폴드 를 생성하는 주요 과제 중 하나는 전기 방사 매개 변수가 매번 동일하다는 것을 측정하고 결정하는 것입니다. 따라서 스캐폴드를 생성할 때마다 매번 스캐폴드가 동일한지 확인하기 위해 컬렉터 거리, 습도 및 온도를 측정해야 합니다. 이 모델의 성공에 중요한 것은 절차 전반에 걸쳐 자발적인 환기를 허용하는 마취의 올바른 평면의 미세 수술 기술 및 유지 보수의 정제입니다.
호스트 기관체는 약 1밀리미터의 내부 직경을 가지고 있기 때문에, 이식및 네이티브 조직 처리 및 봉합사 배치는 시각적으로 가장 중요하고 가장 잘 입증됩니다. 육각형플루오로이소프로파놀에서 8중량% 폴리에틸렌 테레프탈레이트 또는 PET를 용해하고 그 결과 용액을 섭씨 60도로 가열하여 시작합니다. 용액이 따뜻해지는 동안, PET 솔루션이 냉각되면 솔루션을 결합하여 헥사플루오로이소프로판올에 3 중량%의 폴리우레탄 또는 PU를 용해합니다.
폴리머 혼합물을 장착한 60밀리리터 주사기를 20게이지 블런트 팁 바늘로 적재합니다. 주사기와 바늘에 긍정적 인 14 킬로볼트로 설정 된 고전압 DC 전원 공급 장치, 또 다른 고전압 DC 전원 공급 장치를 마이너스 3 킬로볼트로 설정하고, 시간당 5 밀리리터 - 투 - 기질 거리, 그리고 1 밀리미터 직경의 스테인리스 강막대에 전기 스핀20 센티미터 팁 - 기판 거리를 사용합니다. 300 마이크로미터 스캐폴드 벽 두께가 달성될 때까지 전기 회전을 계속합니다.
그런 다음, 스캐폴드를 낚싯대에서 밀어내고, 하룻밤 동안 진공 밑에 비계를 놓고 잔류 용매를 제거하고, 약 15분 동안 센티미터당 350밀리줄의 자외선 투여량으로 비계를 살균한다. 멸균 조건하에서, 6-8주 된 암컷, 미세 가위 및 마이크로 Adson 집게를 가진 C57-Black/6 마우스의 뒷다리에서 피부를 제거하고, Dumont 넘버 5 포셉과 듀몬트 넘버 5/45 포셉을 사용하여 근막과 힘줄을 제거합니다. 뼈를 분리하여 양쪽 끝에서 잘라낼 수 있도록 하고, 25게이지 바늘이 장착된 5밀리리터 주사기를 사용하여 골수를 RPMI 배지 30밀리리터를 함유한 페트리 접시에 넣습니다.
모든 뼈가 플러시되면 70 마이크로미터 나일론 세포 여과기를 통해 골수를 50밀리리터 원추형 튜브로 필터링하고 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 옮긴다. 층을 혼합하지 않고 폴리수크로오스와 디아트리조아테 5밀리리터를 포함하는 15밀리리터 튜브의 측면에 여과된 단핵 세포 용액을 부드럽게 추가하고 밀도 그라데이션 분리에 의해 백색 및 적혈구로부터 플라즈마를 분리한다. 원심분리의 끝에서, 골수 단핵 세포로 구성된 중간 명확한 층을 수집하고, 원심분리에 의해 PBS에서 1 대 1 비율로 골수 단일 핵 세포를 세척한다.
두 번째 세척을 위해 PBS의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 카운트에 대한 신선한 RPMI 매체의 10 밀리리터에 재서스펜션. 이어서, 추가 원심분리를 사용하여 세포를 수집하고, 신선한 RPMI 농도의 5개의 마이크로리터 당 7개의 세포로 세포를 1회 10으로 희석한다. 스캐폴드를 시드하기 전에 필요에 따라 폴리머를 5mm 길이로 자르고 5분 동안 RPMI 배지5마이크로리터로 스캐폴드를 적십합니다.
인큐베이션의 끝에서, 과잉 매체를 제거하고, 골수 단핵 세포 용액의 5마이크로리터로 스캐폴드 루멘을 10분 동안 적재한다. 이어서, 스캐폴드의 루멘을 통해 21게이지 바늘을 삽입하고, 37도 섭씨 인큐베이터에 밤새 RPMI 배지의 1밀리리터에 이식편을 놓는다. 전신 마취를 유도 한 후, 받는 사람의 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고, 동물의 눈에 연고를 적용합니다.
턱에서 clavicles에 수술 부위에 머리를 잘라, 등대 구형 위치에 수술 패드에 동물을 배치. 무균 기술을 사용하여 순차적인 포비도요오드, 70%에탄올, 포비도오드 요오드 와이프 시리즈로 수술 부위를 소독하고 12시에 머리와 함께 해부 현미경으로 마우스를 이동시다. 미세 한 가위와 마이크로 Adson 집게를 사용하여 클라비클에서 효이드 뼈로의 중간 선 절개를 하고, Dumont 번호 5 번과 7 번 미세 포셉과 멸균 면봉을 사용하여 파시카를 청소한 후 자체 유지 Colibri 재트랙터를 절개에 삽입하십시오.
집게를 사용하여 스트랩 근육을 열어 갑상선 연골, 크리피드 연골 및 기관지를 노출시키고 조직의 양쪽에서 평행하게 실행되는 재발하는 후두 신경과 기관을 무뚝뚝하게 분리한 다음 식도에서 기관체의 둘레 분리를 합니다. 20 게이지 바늘과 수술 마커를 사용하여 기관지의 전방 부분을 얼룩지게합니다. Vannas-Tubingen 스프링 가위와 듀몬트 넘버 7 미세 집게 를 사용하여 세 번째 기관 연골 반지 아래에서 절개를하여 기관지의 3링 섹션을 절제하십시오.
미세 곡선 포셉으로 기관추를 잡고, 멸균 9-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉골에 대한 기관의 단부 단부를 확보하고, 20 게이지 바늘과 외과 마커를 사용하여 접목의 전방 부분을 염색한다. 이식편을 이식하려면 9-0멸균 나일론 봉합사, 듀몬트 번호 7 미세 집게 및 바늘 홀더를 사용하여 근위 후방, 근위 측삭 및 근위 전방 바늘을 삽입하고 동물을 180도 돌립니다. 마우스가 위치에 있을 때, 일시적인 기관 절제술을 방출하고, 말단 해부학을 용이하게 하기 위해 이식편의 전방 부분에서 5밀리미터 떨어진 측면 절개를 한다.
불경하를 완성하려면 봉합사를 근위 적층과 유사한 방식으로 배치하고 접목 위치와 스트랩 근육을 다시 근사화하십시오. 그런 다음, 9-0 멸균 나일론 봉합사를 실행 패턴으로 절개를 닫고, 전체 복구까지 모니터링과 가열 패드에 배치 복구 케이지에 혼자 동물을 배치합니다. 이식 후 2 주, 몇 기저 상피 세포는 조직 공학 기관 이식 조직 섹션에서 기저 세포 각질 5 및 14 염색에 의해 관찰 될 수있다.
기저 세포는 또한 이식 후 7 일 에서 접목의 발광 표면에서 검출됩니다. 방호 및 조직학적 분석에 따라, 이식협은 호흡 곤란과 황장의 징후를 보여주는 이식 이식 마우스의 주요 기여 요인으로 확인되었습니다. 접목과 네이티브 기관의 텔레스코핑은 수술 기술의 결과로 일반적인 발견이다.
F4/80에 대한 염색은 기저 상피 세포의 존재와 함께 접목의 스테노틱 영역 내의 숙주 대식세포를 나타낸다. 재발하는 후두 신경의 조작을 피하고, 해부학에서 밀폐 씰을 허용하기 위해 근위 및 단부 봉합사가 제자리에 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 생물 안전 수준 1 에이전트 마우스에서 파생된 골수 단핵 세포를 다루기 때문에 오염을 피하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 중요합니다.
