이 연구는 국립 연구 재단의 Korea(NRF) 사역의 과학 및 ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345)와 Nano·를 통해 글로벌 연구 개발 센터 프로그램에 의해 부분적으로 지원 되었다 소재 기술 개발 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610)에 의해 자금. 서울 대학교에서 공학 연구 연구소가이 작품에 대 한 연구 시설을 제공합니다. 저자 무서 워 분석에 대 한 형광 분광학에 관한 태 영 윤 (생물 과학, 서울 대학교)으로 감사를 인정.

1. 6 DNA 아코디언 랙 caDNAno14 여 6의 디자인
<ol><li>다운로드 하 고 설치 하는 것은 DNA의 아코디언 랙 디자인 caDNAno 2.0 소프트웨어14 (caDNAno 2.5는 또한 https://github.com/cadnano/cadnano2.5에서 사용할 수). CaDNAno14 을 사각형 격자와 새로운 부품 추가 하려면 사각형 도구 를 클릭 합니다.</li>
	<li>각 광선의 아코디언 랙 번호 고 caDNAno14 (그림 2)의 왼쪽된 격자 패널에 그립니다.</li>
	<li>연필 도구를 클릭 하 고 각 빔 caDNAno14에 바로 편집 패널에 그립니다. 휴식 모든 32 광선 bp, 인접 한 광선 사이 관절입니다. 스테이플 크로스 관절와 같은 위치에 배치 합니다. 추가 단일 가닥 크로스는 관절을 caDNAno14 삽입 도구 와 연필 도구 를 사용 합니다.</li>
	<li>연필 도구 를 클릭 하 고 연결 하는 관절. 각 광선 7 개의 관절 있다.</li>
	<li>라우팅 알고리즘11이전에 보고 된 비 계를 사용 하 여 단일 루프에는 건설 기계를 병합 하 비 계 크로스 오버를 생성 합니다. 미만 8 비 계 및 스테이플 가닥 사이 최소 바인딩 도메인 못하게 bp (그림 3).</li>
	<li>그림 3에서 보듯이 아코디언 랙의 반대편에 있는 정점에 있는 어셈블리에서 사용 되지 않는 건설 기계를 놓습니다.</li>
	<li>휴식 도구를 클릭 합니다. 스테이플 물가 원형 또는 이상-60 가닥 휴식 혈압.</li>
	<li>디자인 DNA 잠금 가닥.<ol>
<li>휴식 도구를 클릭 합니다. 스티커 부분을 삭제 8 주식 DNA 영역의 휴식 8 bp 주식 DNA 영역의 혈압. 6 여 6 아코디언 랙에서 18 스티커 부분 (그림 1)가 있다.</li>
		<li>역방향 시퀀스 스티커 부분에 보완 잠금 가닥의 양쪽 끝에 놓고 원하는 길이 (그림 1B)의 폴 리 T 가닥으로 구성 된 브리징 지역별 그들을 연결 합니다.</li>
		<li>재구성, 추가 8 bp DNA의 끝 발 시퀀스의 가닥 변위에 대 한 잠급니다. 표 2에 사용 하는 발 순서가입니다.</li>
		<li>브리징 지역에 무료 리버스는 폴 리 A 가닥을 준비 합니다.</li>
		<li>디자인 가닥을 반대로 재구성 실험에 대 한 DNA 자물쇠를 보완.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시퀀스 도구 를 클릭 하 고 비 계 DNA를 클릭 합니다. 선택 발판으로 표준 M13mp18. 내보내기 도구 를 클릭 그리고 csv 형식 (표 1) 시퀀스를 저장 합니다.</li>
</ol>2. 구조는 oxDNA 시뮬레이션
<ol><li>다운로드 및 설치 oxDNA16,17. 최신 소스 코드는 https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/에 있습니다.</li>
	<li>CaDNAno14 파일 'cadnano_interface.py', oxDNA,1617 패키지에서 제공 되는 파이썬 스크립트를 사용 하 여 시작 구성 파일을 확인 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '파이썬 cadnano_interface.py cadnano_file.json 스퀘어'. 토폴로지 파일 및 구성 파일 이제 생성 됩니다. 참고: 토폴로지 파일 포함 얼마나 많은 가닥 그리고 뉴클레오티드 뉴클레오티드 사이 백본 백본 채권에 관한 정보와 구조에 있습니다. 구성 파일 timestep, 에너지, 및 크기와 같은 일반 정보를 포함합니다. 위치 벡터, 백본 기반 벡터, 법선 벡터, 속도, 뉴클레오티드의 각 속도 등 방향 정보 포함된 (그림 4) 이기도합니다.</li>
	<li>아코디언 랙 진짜 구조 정보를 반영 수 있도록 caDNAno14 에서 토폴로지 및 구성 파일에서 정보를 변경 합니다. 모든 빔 caDNAno14 에서 토폴로지 및 구성 파일 시각화 때 병렬 정렬 됩니다. 그러나, 아코디언 랙 이므로 격자 구조 보 세 뉴클레오티드 사이의 거리는 훨씬 시뮬레이션 (그림 5).<ol>
<li>회전 하 고 원하는 격자 구조에 각 광속을 이동 합니다. 구성 파일에서 왼쪽에 9 열은 위치 벡터, 백본 기반 벡터와 법선 벡터 (그림 4). 광선을 회전, 회전 위치의 모든 회전 변환을 사용 하 여 백본 기반 및 정상적인 벡터. 다음 그림 5에서 보듯이 그것을 찾을 위치 벡터를 변경 하 여 광선을 이동 합니다.</li>
		<li>OxDNA 패키지에서 제공 하는 스크립트를 사용 하 여 구조를 이완 ($oxDNA에서 예를 참조 하십시오/예/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION에 대 한 추가 정보).</li>
	</ol>
</li>
	<li>편안 하 게 구성 파일을 사용 하 여 10 백만 단계에 대 한 분자 동역학 시뮬레이션을 실행 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '. / oxDNA < 입력 >' 5000 또는 10000 단계 모든 데이터를 저장.</li>
	<li>시각화 참고: 구조는 cogli를 사용 하 여 시각화 했다.<ol>
<li>다운로드 및 cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/)의 최신 버전을 설치.</li>
		<li>OxDNA 시뮬레이션에서 토폴로지 및 구성 파일에서 cogli를 실행 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '. / cogli1-t < 토폴로지 파일 >< 구성 파일 >'.</li>
		<li>B를 눌러 상자를 숨깁니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 합성 구조
참고: 합성 메서드를 사용 하면 이전 프로토콜15,18에서 적응 시켰다.
<ol><li>설계 된 DNA 스테이플 oligonucleotide 공급자 로부터 구입.</li>
	<li>이러한 DNA 스테이플 nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 μ M에의 농도 조정 합니다.<ol>
<li>1 개의 관으로 '자유 국가' 구조를 구성 하는 각 DNA 가닥을 수영장 고 각 물가 위한 2 μ M에 농도 조정 합니다.</li>
		<li>수영장 DNA 잠금 튜브 길이와 잠금 사이트 긴 고 각 물가 위한 2 μ M 농도 조정 합니다. 18, 9, 및 4 잠금 사이트 사용 됩니다. 폴 리 A 가닥 같은 농도에서 브리지 지역에 보완 하는 추가 합니다.</li>
		<li>DNA에 보완 리버스는 수영장 가닥 튜브 길이 여 가닥을 잠글 고 각 물가 위한 2 μ M 농도 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>300의 MgCl2 솔루션 준비 nuclease 무료 물 70 μ 1 μ M MgCl2 솔루션의 30 μ를 혼합 하 여 nM. 트리 스 EDTA 솔루션 x 5 95 μ nuclease 무료 물 100 x 트리 EDTA 솔루션의 5 μ를 혼합 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>추가 주식 DNA, MgCl2 솔루션의 1.1 μ의 2 μ, 트리 스 EDTA 솔루션, nuclease 무료 물 7.6 μ와 비 계 DNA의 농도 110의 7.3 μ의 2 μ 혼합 주식의 20 μ 있도록 nM. 설정 비 계 DNA의 최종 농도 40 nM, 200 nM, MgCl2 16 m m와 0.5 Tris EDTA 솔루션 DNA 주식 x.</li>
	<li>빠르게 60 ° C ° C 당 40 분의 속도에서 4 ° C에서에서 80 ° C에 열 cycler에 멋진 혼합된 재고 솔루션 ° C와 멋진 당 4 분의 속도로 60 ° C에 열</li>
</ol>4입니다. 구조의 정화
참고: 모든 구조의 샘플 분석 하기 전에 정화 했다. 이 섹션에서 우리는 이전 문학19에서 적응 못 정화의 프로토콜을 설명 합니다. 이전 문학15,18에 설명 된 대로 샘플 또한 젤 전기 이동 법으로 정화 수 있습니다.
<ol><li>5 M NaCl 및 100 x 트리 스-EDTA의 준비.</li>
	<li>던지다 8000, 트리 스 EDTA x 100의 500 μ와 5 M NaCl의 101 μ nuclease 무료 물 249 μ의 150 μ를 혼합 하 여 강 수-버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>섹션 3.3에서 300 nM MgCl2 솔루션의 5.5 μ, 섹션 3.3에서 5 배 트리 스 EDTA 솔루션의 10 μ, nuclease 무료 물 84.5 μ를 혼합 하 여 대상 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>제 3 강 수-버퍼 섹션 4.2에서 20 μ에서 합성된 구조의 믹스 20 μ. 다음 4 ° c.에서 16000 x g에서 혼합된 재고 회전 상쾌한을 제거 하 고 섹션 4.3에서 대상 버퍼에 펠 릿을 디졸브.</li>
</ol>5. '잠긴 상태' 에서' 무료' 아코디언 랙의 재구성
<ol><li>구성 실험에 대 한 DNA 잠금 없이 구조를 음성 합성.</li>
	<li>섹션 3에서 DNA 잠금 가닥을 준비 합니다.</li>
	<li>합성 구조 20 μ로 원하는 길이의 DNA 잠금 물가의 2 μ를 추가 합니다. DNA 잠금 가닥 농도 구조 보다 5 배 높은 수준 이다.</li>
	<li>0, 10, 25, 50에 대 한 샘플을 품 어 또는 얼마나 빨리 재구성을 보고 100 분 발생 합니다.<ol>
<li>100 분 보육에 대 한 샘플 50 ° C에서 30 분 동안 품 어 고 천천히 0.33 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>50 분 보육에 대 한 샘플 50 ° C에서 15 분 동안 품 어 고 천천히 0.66 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>25 분 화 7.5 분에 대 한 50 ° C에서 샘플을 품 어 고 천천히 1.32 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각.</li>
		<li>10 분 부 화에 대 한 샘플 50 ° C에서 3 분 동안 품 어 고 천천히 3.3 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>0 분 보육에 대 한 DNA 가닥을 잠근 후 4 ° C에 게 샘플 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>연결 단계 직후 원치 않는 변성을 방지 하기 위해 4 ° C에 샘플을 식혀 급속 하 게.</li>
</ol>6. '자유 국가'에 '고정 상태'에서 아코디언 랙의 재구성
<ol><li>음성 합성 구성 실험에 대 한 원하는 길이의 DNA 자물쇠 구조.</li>
	<li>섹션 3에서 역방향 보완 가닥을 준비 합니다.</li>
	<li>합성 구조 20 μ로 원하는 길이 잠금 가닥에 무료 리버스는 물가의 2 μ를 추가 합니다. DNA 잠금 가닥 농도 구조 보다 5 배 높은 수준 이다.</li>
	<li>0, 12, 60, 120에 대 한 샘플을 품 어, 240 분을 보고 얼마나 빨리 재구성 발생 합니다.<ol>
<li>12, 60, 120, 240 분 보육에 대 한 신속 하 게 샘플 40 ° C에가 열 하 고 천천히 각각에 해당 하는 시간에 대 한 20 ° C까지 냉각 하십시오. 바로 파견 단계 후 4 ° c 원치 않는 변성을 방지 하기 위해 샘플을 식혀 급속 하 게.</li>
		<li>0 분 인큐베이션 역방향 보완 가닥 추가 된 후 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 편 영상
참고: 가장 이미징 프로토콜 이전 문학18,20에서 적응 했다.
<ol><li>1.25 M NaOH 솔루션 nuclease 무료 물 87.5 μ와 10 M NaOH 솔루션의 12.5 μ를 혼합 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>2 %uranyl 편대 솔루션의 50 μ를 1.25 M NaOH 솔루션의 1 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>3 분, 3 분 동안 최대 속도로 원심 분리기에 대 한 솔루션 소용돌이. 3 분 동안 글로우 방전 가장 격자에 순화 된 샘플의 3 μ 보증금과 빠르게 필터 종이 밖으로 씻어.</li>
	<li>30 초 동안 준비 uranyl 편대 솔루션의 7 μ 보증금과 빠르게 필터 종이 밖으로 씻어.</li>
	<li>길이 아코디언 구조를 가장 하 여 몇 군데의 각도 측정 합니다.</li>
</ol>8. 무서 워 분석
<ol><li>Atto 550를 Förster 거리는 6.5 거 647N 염료를 사용 하 여 nm. 주식 58와 주식 117 표 1 에 놓여있는지 이라는 가닥 바꿉니다. 다음 섹션 3에서 설명 하는 방법으로 붙일 이라는 물가 구조를 음성 합성.</li>
	<li>순화 된 샘플의 농도 측정 합니다.</li>
	<li>384 microplates 10 nM와 부하 50 μ를 샘플 잘 정상화.</li>
	<li>기증자와 수락자 염료 550 nm에서 측정 샘플을 자극 570에서 형광 스펙트럼 800 nm는 fluorometer nm.</li>
	<li>같은 방법으로 기증자 전용 샘플의 형광 스펙트럼을 측정 합니다.</li>
	<li>650에서 샘플의 염료를 흥분 nm 및 형광 스펙트럼 측정 670에서 800 nm nm. 이것은 수락자의 농도 측정 하입니다.</li>
	<li>3 샘플, 합성 되 고 별도로 정화는 같은 실험을 반복 하 여 표준 편차를 얻을.</li>
	<li>무서 워 효율성 비율21아래 방정식에 의해 설명 된 대로 메서드를 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> 다550: 기증자와 수락자 550 nm 여기에서 샘플의 수락자 피크 형광 강도. D550: 550 nm 여기에서 기증자 전용 샘플의 수락자 방출 범위에서 형광 강도. 다650: 기증자와 수락자 650 nm 여기에서 샘플의 수락자 피크 형광 강도.</li>
</ol>

<ol>
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저자 공개할 게 없다

이 프로토콜은 디자인, 시뮬레이션, 합성, 그리고 기본적인 2D DNA 아코디언 랙의 분석에서 전체 과정을 소개합니다. 수정 된 설계 및 시뮬레이션 규칙 있다 설명 디자인 규칙의 표준 DNA 종이 접기, 다르기 때문에 DNA 아코디언 랙 추가 뉴클레오티드 유연성14,15크로스 오버에서. 이것에서 우리는 프로토콜 DNA 아코디언 선반을 사용 하 여 다양 한 연구를 가?...

그들은 생산을 나노미터 2D 및 3D의 복잡 한 나노 모션 때문에 DNA nanostructures 또는 DNA 빠져나가기1,2,3,,45 에 따라 기계 시스템 독특합니다. ångström 해상도, 다양 한 바이오 자극2,,36에 따르면. 이러한 구조에 기능성 소재를 연결 하 고 그들의 위치를 제어,이 구조는 다양 한 분야에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 DNA 빠져나가기를 분자 원자로7, 마약 배달8및 nanoplasmonic 시스템9,10에 대 한 제안 되었습니다.
이전에 우리는 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 요소11 (그림 1A)의 2D 또는 3D 나노 네트워크를 조작할 수 있는 도입. 단지 몇 가지 요소를 제어 하는 다른 DNA 지지, 달리 플랫폼 공동으로 다양 한 단계에 주기적으로 기준점과 2D 또는 3D 요소 조작할 수 있습니다. 우리는 프로그래밍 가능한 화학 및 생물 반응 네트워크 또는 분자 컴퓨팅 시스템 건축 될 수 있다 우리의 시스템에서 관리할 수 있는 요소의 수를 늘려 예상. DNA 아코디언 랙 여러 DNA 광선의 네트워크가 단일 가닥 DNA (그림 1B)의 구성 된 관절에 연결 되어 있는 구조입니다. 아코디언 랙 DNA 빔에 의해 생성 된 DNA 자물쇠 광선의 스티커 부분에 교배 하 고 브리징 부분의 잠금 (잠금된 상태)의 길이 따라 빔 사이의 각도 변경 하 여 다시 구성 됩니다. 또한, 다단계 재구성은 DNA 가닥 발 기반 변위12,13자물쇠를 분리 하 여 자유 상태의 형성 후 새로운 자물쇠를 추가 하 여 보여 줍니다.
이 프로토콜에서 우리는 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 전체 설계 및 합성 과정을 설명합니다. 프로토콜 설계, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험, 및 6에 의해 6 메시의 DNA 아코디언 랙 및 이러한 재구성의 합성에 대 한 분석을 포함 한다. 프로토콜에서 설명 하는 구조는 이전 연구11 의 기본 모델 이며 65 nm 65 여 14 빔으로 구성 된 크기에 nm. 설계 및 시뮬레이션, 아코디언 랙의 구조 설계는 기존의 DNA 종이 접기14,15 (즉, 단단히 포장)에서 다르다. 따라서, 설계 규칙 및 분자 시뮬레이션 전통적인 방법에서 수정 되었습니다. 설명 하기 위해, 우리는 caDNAno14 의 수정 된 접근 및 아코디언 랙 추가 스크립트 oxDNA16,17 를 사용 하 여 시뮬레이션을 사용 하 여 설계 기법을 보여줍니다. 마지막으로, 구성 된 아코디언 랙 구조 분석에 대 한 가장 및 무서 워 두 프로토콜 설명 되어 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>M13mp18 Single-stranded DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2 Solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>M2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T2142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>s2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate</td>
			<td>Thomas Science</td>
			<td>C993L42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodropic 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM (LIBRA 120)&#160;&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer Enspire 2300</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>LZ-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

DNA nanostructure 기반 기계 시스템 또는 ångström 해상도를 나노미터 2D 및 3D의 복잡 한 나노 모션 생성, DNA 빠져나가기 약물 전달, 분자 원자로 등 나노기술의 다양 한 분야에서 큰 잠재력을 표시 그리고 nanoplasmonic 시스템입니다. 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 수 총칭 조작 요소, 2D 또는 3D 나노 네트워크 응답 DNA 입력으로 여러 단계에서를 설명 합니다. 플랫폼은 DNA 빠져나가기 재구성의 여러 단계와 네트워크 규모에 몇 가지 요소에서 제어할 수 있는 요소 수를 늘릴 가능성이 있다.
이 프로토콜에 우리는 6에 의해 6 메쉬 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 전체 실험 과정을 설명합니다. 프로토콜 구조와 합성 및 재구성에 대 한 젖은 실험실 실험의 설계 규칙 및 시뮬레이션 절차 포함 되어 있습니다. 또한, 가장 (전송 전자 현미경 검사 법)과 무서 워 (형광 공명 에너지 전달)를 사용 하 여 구조 분석 프로토콜에 포함 됩니다. 이 프로토콜에서 설명 소설 설계 및 시뮬레이션 방법을 연구원 추가 응용 프로그램에 대 한 DNA 아코디언 랙을 사용 하 여 도움이 됩니다.

설계 된 6 월 6 일에 의해 DNA 아코디언 랙 oxDNA16,17 에서 시뮬레이션 하 고 결과 그림 6에 표시 됩니다. 시뮬레이션 결과에서 구조 왜곡 없이 원하는 구조 형성은 확인 되었다.
그림 7 에서 가장 이미지는 2, 8, 13, 20 bp 길이의 잠금 구성 된 구?...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

우리는 디자인, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험 및 아코디언 랙 6으로 6 메시의 DNA의 재구성에 대 한 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

재구성 가능한 DNA 아코디언 랙의 설계 및 합성

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K 조회수.  Seoul National University. 우리는 디자인, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험 및 아코디언 랙 6으로 6 메시의 DNA의 재구성에 대 한 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

실버 씨앗 중재 성장 방법과 골드 Nanostar 합성

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

연구

생체공학

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

화학 합성 및 시간 - 해결 기계론의 연구 Millifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or reactions. A microfluidic channel that deforms even after fabrication while retaining the channel shape enables high spatiotemporal reconfigurability. This reconfigurability is required in such key microfluidic functions that are difficult to achieve in existing "reconfigurable" or "integrated" microfluidic systems. We describe a method for the fabrication of a microfluidic channel with a deformable sidewall consisting of a laterally aligned array of the ends of rectangular pins. Actuating the pins in their longitudinal directions changes the pins' end positions, and thus, the shape of discretized channel sidewalls.Pin gaps can cause unwanted leakage or adhesion to adjacent pins caused by meniscus forces. To close the pin gaps, we have introduced hydrocarbon-fluoropolymer suspension-based gap filler accompanied by an elastomeric barrier. This reconfigurable microfluidic device can generate strong temporal in-channel displacement flow, or can stop the flow in any region of the channel. This feature will facilitate, on demand, the handling of cells, viscous liquids, gas bubbles, and non-fluids, even if their existence or behavior is unknown at the time of fabrication.

A microfluidic channel with deformable sidewalls offers flow control, particle handling, channel dimension customization and other reconfigurations while in use. We describe a method for fabricating a microfluidic channel with sidewalls made of an array of pins that allows their shape to change.

재구성 가능한 미세 채널 핀 분할 측 벽

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

오픈 소스, 저비용 바이오 잉크 및 식품 용융 압출 3D 프린터 설계

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of breath. LTS results from mucosal injury from a foreign body in the trachea, leading to tissue damage and a local inflammatory response that goes awry, leading to the deposition of pathologic scar tissue. Treatment for LTS is surgical due to the lack of effective medical therapies. The purpose of this method is to construct a biocompatible stent that can be miniaturized to place into mice with LTS. We demonstrated that a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) construct had optimal biomechanical strength, was biocompatible, practicable for an in vivo placement stent, and capable of eluting drug. This method provides a drug delivery system for testing various immunomodulatory agents to locally inhibit inflammation and reduce airway fibrosis. Manufacturing the stents takes 28&#8722;30 h and can be reproduced easily, allowing for experiments with large cohorts. Here we incorporated the drug rapamycin within the stent to test its effectiveness in reducing fibrosis and collagen deposition. Results revealed that PLLA-PCL tents showed reliable rapamycin release, were mechanically stable in physiological conditions, and were biocompatible, inducing little inflammatory response in the trachea. Further, the rapamycin-eluting PLLA-PCL stents reduced scar formation in the trachea in vivo.

Laryngotracheal stenosis results from pathologic scar deposition that critically narrows the tracheal airway and lacks effective medical therapies. Using a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) stent as a local drug delivery system, potential therapies aimed at decreasing scar proliferation in the trachea can be studied.

후두절협증을 가진 마우스에 있는 생체 적합성 약 용출 기관 스텐트의 디자인

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...