Name: design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack at JoVE.com

이 연구는 국립 연구 재단의 Korea(NRF) 사역의 과학 및 ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345)와 Nano·를 통해 글로벌 연구 개발 센터 프로그램에 의해 부분적으로 지원 되었다 소재 기술 개발 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610)에 의해 자금. 서울 대학교에서 공학 연구 연구소가이 작품에 대 한 연구 시설을 제공합니다. 저자 무서 워 분석에 대 한 형광 분광학에 관한 태 영 윤 (생물 과학, 서울 대학교)으로 감사를 인정.

1. 6 DNA 아코디언 랙 caDNAno14 여 6의 디자인
<ol><li>다운로드 하 고 설치 하는 것은 DNA의 아코디언 랙 디자인 caDNAno 2.0 소프트웨어14 (caDNAno 2.5는 또한 https://github.com/cadnano/cadnano2.5에서 사용할 수). CaDNAno14 을 사각형 격자와 새로운 부품 추가 하려면 사각형 도구 를 클릭 합니다.</li>
	<li>각 광선의 아코디언 랙 번호 고 caDNAno14 (그림 2)의 왼쪽된 격자 패널에 그립니다.</li>
	<li>연필 도구를 클릭 하 고 각 빔 caDNAno14에 바로 편집 패널에 그립니다. 휴식 모든 32 광선 bp, 인접 한 광선 사이 관절입니다. 스테이플 크로스 관절와 같은 위치에 배치 합니다. 추가 단일 가닥 크로스는 관절을 caDNAno14 삽입 도구 와 연필 도구 를 사용 합니다.</li>
	<li>연필 도구 를 클릭 하 고 연결 하는 관절. 각 광선 7 개의 관절 있다.</li>
	<li>라우팅 알고리즘11이전에 보고 된 비 계를 사용 하 여 단일 루프에는 건설 기계를 병합 하 비 계 크로스 오버를 생성 합니다. 미만 8 비 계 및 스테이플 가닥 사이 최소 바인딩 도메인 못하게 bp (그림 3).</li>
	<li>그림 3에서 보듯이 아코디언 랙의 반대편에 있는 정점에 있는 어셈블리에서 사용 되지 않는 건설 기계를 놓습니다.</li>
	<li>휴식 도구를 클릭 합니다. 스테이플 물가 원형 또는 이상-60 가닥 휴식 혈압.</li>
	<li>디자인 DNA 잠금 가닥.<ol>
<li>휴식 도구를 클릭 합니다. 스티커 부분을 삭제 8 주식 DNA 영역의 휴식 8 bp 주식 DNA 영역의 혈압. 6 여 6 아코디언 랙에서 18 스티커 부분 (그림 1)가 있다.</li>
		<li>역방향 시퀀스 스티커 부분에 보완 잠금 가닥의 양쪽 끝에 놓고 원하는 길이 (그림 1B)의 폴 리 T 가닥으로 구성 된 브리징 지역별 그들을 연결 합니다.</li>
		<li>재구성, 추가 8 bp DNA의 끝 발 시퀀스의 가닥 변위에 대 한 잠급니다. 표 2에 사용 하는 발 순서가입니다.</li>
		<li>브리징 지역에 무료 리버스는 폴 리 A 가닥을 준비 합니다.</li>
		<li>디자인 가닥을 반대로 재구성 실험에 대 한 DNA 자물쇠를 보완.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시퀀스 도구 를 클릭 하 고 비 계 DNA를 클릭 합니다. 선택 발판으로 표준 M13mp18. 내보내기 도구 를 클릭 그리고 csv 형식 (표 1) 시퀀스를 저장 합니다.</li>
</ol>2. 구조는 oxDNA 시뮬레이션
<ol><li>다운로드 및 설치 oxDNA16,17. 최신 소스 코드는 https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/에 있습니다.</li>
	<li>CaDNAno14 파일 'cadnano_interface.py', oxDNA,1617 패키지에서 제공 되는 파이썬 스크립트를 사용 하 여 시작 구성 파일을 확인 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '파이썬 cadnano_interface.py cadnano_file.json 스퀘어'. 토폴로지 파일 및 구성 파일 이제 생성 됩니다. 참고: 토폴로지 파일 포함 얼마나 많은 가닥 그리고 뉴클레오티드 뉴클레오티드 사이 백본 백본 채권에 관한 정보와 구조에 있습니다. 구성 파일 timestep, 에너지, 및 크기와 같은 일반 정보를 포함합니다. 위치 벡터, 백본 기반 벡터, 법선 벡터, 속도, 뉴클레오티드의 각 속도 등 방향 정보 포함된 (그림 4) 이기도합니다.</li>
	<li>아코디언 랙 진짜 구조 정보를 반영 수 있도록 caDNAno14 에서 토폴로지 및 구성 파일에서 정보를 변경 합니다. 모든 빔 caDNAno14 에서 토폴로지 및 구성 파일 시각화 때 병렬 정렬 됩니다. 그러나, 아코디언 랙 이므로 격자 구조 보 세 뉴클레오티드 사이의 거리는 훨씬 시뮬레이션 (그림 5).<ol>
<li>회전 하 고 원하는 격자 구조에 각 광속을 이동 합니다. 구성 파일에서 왼쪽에 9 열은 위치 벡터, 백본 기반 벡터와 법선 벡터 (그림 4). 광선을 회전, 회전 위치의 모든 회전 변환을 사용 하 여 백본 기반 및 정상적인 벡터. 다음 그림 5에서 보듯이 그것을 찾을 위치 벡터를 변경 하 여 광선을 이동 합니다.</li>
		<li>OxDNA 패키지에서 제공 하는 스크립트를 사용 하 여 구조를 이완 ($oxDNA에서 예를 참조 하십시오/예/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION에 대 한 추가 정보).</li>
	</ol>
</li>
	<li>편안 하 게 구성 파일을 사용 하 여 10 백만 단계에 대 한 분자 동역학 시뮬레이션을 실행 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '. / oxDNA < 입력 >' 5000 또는 10000 단계 모든 데이터를 저장.</li>
	<li>시각화 참고: 구조는 cogli를 사용 하 여 시각화 했다.<ol>
<li>다운로드 및 cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/)의 최신 버전을 설치.</li>
		<li>OxDNA 시뮬레이션에서 토폴로지 및 구성 파일에서 cogli를 실행 합니다. 사용법은 다음과 같습니다: '. / cogli1-t < 토폴로지 파일 >< 구성 파일 >'.</li>
		<li>B를 눌러 상자를 숨깁니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 합성 구조
참고: 합성 메서드를 사용 하면 이전 프로토콜15,18에서 적응 시켰다.
<ol><li>설계 된 DNA 스테이플 oligonucleotide 공급자 로부터 구입.</li>
	<li>이러한 DNA 스테이플 nuclease 무료 물을 사용 하 여 100 μ M에의 농도 조정 합니다.<ol>
<li>1 개의 관으로 '자유 국가' 구조를 구성 하는 각 DNA 가닥을 수영장 고 각 물가 위한 2 μ M에 농도 조정 합니다.</li>
		<li>수영장 DNA 잠금 튜브 길이와 잠금 사이트 긴 고 각 물가 위한 2 μ M 농도 조정 합니다. 18, 9, 및 4 잠금 사이트 사용 됩니다. 폴 리 A 가닥 같은 농도에서 브리지 지역에 보완 하는 추가 합니다.</li>
		<li>DNA에 보완 리버스는 수영장 가닥 튜브 길이 여 가닥을 잠글 고 각 물가 위한 2 μ M 농도 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>300의 MgCl2 솔루션 준비 nuclease 무료 물 70 μ 1 μ M MgCl2 솔루션의 30 μ를 혼합 하 여 nM. 트리 스 EDTA 솔루션 x 5 95 μ nuclease 무료 물 100 x 트리 EDTA 솔루션의 5 μ를 혼합 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>추가 주식 DNA, MgCl2 솔루션의 1.1 μ의 2 μ, 트리 스 EDTA 솔루션, nuclease 무료 물 7.6 μ와 비 계 DNA의 농도 110의 7.3 μ의 2 μ 혼합 주식의 20 μ 있도록 nM. 설정 비 계 DNA의 최종 농도 40 nM, 200 nM, MgCl2 16 m m와 0.5 Tris EDTA 솔루션 DNA 주식 x.</li>
	<li>빠르게 60 ° C ° C 당 40 분의 속도에서 4 ° C에서에서 80 ° C에 열 cycler에 멋진 혼합된 재고 솔루션 ° C와 멋진 당 4 분의 속도로 60 ° C에 열</li>
</ol>4입니다. 구조의 정화
참고: 모든 구조의 샘플 분석 하기 전에 정화 했다. 이 섹션에서 우리는 이전 문학19에서 적응 못 정화의 프로토콜을 설명 합니다. 이전 문학15,18에 설명 된 대로 샘플 또한 젤 전기 이동 법으로 정화 수 있습니다.
<ol><li>5 M NaCl 및 100 x 트리 스-EDTA의 준비.</li>
	<li>던지다 8000, 트리 스 EDTA x 100의 500 μ와 5 M NaCl의 101 μ nuclease 무료 물 249 μ의 150 μ를 혼합 하 여 강 수-버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>섹션 3.3에서 300 nM MgCl2 솔루션의 5.5 μ, 섹션 3.3에서 5 배 트리 스 EDTA 솔루션의 10 μ, nuclease 무료 물 84.5 μ를 혼합 하 여 대상 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>제 3 강 수-버퍼 섹션 4.2에서 20 μ에서 합성된 구조의 믹스 20 μ. 다음 4 ° c.에서 16000 x g에서 혼합된 재고 회전 상쾌한을 제거 하 고 섹션 4.3에서 대상 버퍼에 펠 릿을 디졸브.</li>
</ol>5. '잠긴 상태' 에서' 무료' 아코디언 랙의 재구성
<ol><li>구성 실험에 대 한 DNA 잠금 없이 구조를 음성 합성.</li>
	<li>섹션 3에서 DNA 잠금 가닥을 준비 합니다.</li>
	<li>합성 구조 20 μ로 원하는 길이의 DNA 잠금 물가의 2 μ를 추가 합니다. DNA 잠금 가닥 농도 구조 보다 5 배 높은 수준 이다.</li>
	<li>0, 10, 25, 50에 대 한 샘플을 품 어 또는 얼마나 빨리 재구성을 보고 100 분 발생 합니다.<ol>
<li>100 분 보육에 대 한 샘플 50 ° C에서 30 분 동안 품 어 고 천천히 0.33 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>50 분 보육에 대 한 샘플 50 ° C에서 15 분 동안 품 어 고 천천히 0.66 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>25 분 화 7.5 분에 대 한 50 ° C에서 샘플을 품 어 고 천천히 1.32 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각.</li>
		<li>10 분 부 화에 대 한 샘플 50 ° C에서 3 분 동안 품 어 고 천천히 3.3 ° C/분의 속도로 25 ° C까지 냉각 하십시오.</li>
		<li>0 분 보육에 대 한 DNA 가닥을 잠근 후 4 ° C에 게 샘플 추가 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>연결 단계 직후 원치 않는 변성을 방지 하기 위해 4 ° C에 샘플을 식혀 급속 하 게.</li>
</ol>6. '자유 국가'에 '고정 상태'에서 아코디언 랙의 재구성
<ol><li>음성 합성 구성 실험에 대 한 원하는 길이의 DNA 자물쇠 구조.</li>
	<li>섹션 3에서 역방향 보완 가닥을 준비 합니다.</li>
	<li>합성 구조 20 μ로 원하는 길이 잠금 가닥에 무료 리버스는 물가의 2 μ를 추가 합니다. DNA 잠금 가닥 농도 구조 보다 5 배 높은 수준 이다.</li>
	<li>0, 12, 60, 120에 대 한 샘플을 품 어, 240 분을 보고 얼마나 빨리 재구성 발생 합니다.<ol>
<li>12, 60, 120, 240 분 보육에 대 한 신속 하 게 샘플 40 ° C에가 열 하 고 천천히 각각에 해당 하는 시간에 대 한 20 ° C까지 냉각 하십시오. 바로 파견 단계 후 4 ° c 원치 않는 변성을 방지 하기 위해 샘플을 식혀 급속 하 게.</li>
		<li>0 분 인큐베이션 역방향 보완 가닥 추가 된 후 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 편 영상
참고: 가장 이미징 프로토콜 이전 문학18,20에서 적응 했다.
<ol><li>1.25 M NaOH 솔루션 nuclease 무료 물 87.5 μ와 10 M NaOH 솔루션의 12.5 μ를 혼합 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>2 %uranyl 편대 솔루션의 50 μ를 1.25 M NaOH 솔루션의 1 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>3 분, 3 분 동안 최대 속도로 원심 분리기에 대 한 솔루션 소용돌이. 3 분 동안 글로우 방전 가장 격자에 순화 된 샘플의 3 μ 보증금과 빠르게 필터 종이 밖으로 씻어.</li>
	<li>30 초 동안 준비 uranyl 편대 솔루션의 7 μ 보증금과 빠르게 필터 종이 밖으로 씻어.</li>
	<li>길이 아코디언 구조를 가장 하 여 몇 군데의 각도 측정 합니다.</li>
</ol>8. 무서 워 분석
<ol><li>Atto 550를 Förster 거리는 6.5 거 647N 염료를 사용 하 여 nm. 주식 58와 주식 117 표 1 에 놓여있는지 이라는 가닥 바꿉니다. 다음 섹션 3에서 설명 하는 방법으로 붙일 이라는 물가 구조를 음성 합성.</li>
	<li>순화 된 샘플의 농도 측정 합니다.</li>
	<li>384 microplates 10 nM와 부하 50 μ를 샘플 잘 정상화.</li>
	<li>기증자와 수락자 염료 550 nm에서 측정 샘플을 자극 570에서 형광 스펙트럼 800 nm는 fluorometer nm.</li>
	<li>같은 방법으로 기증자 전용 샘플의 형광 스펙트럼을 측정 합니다.</li>
	<li>650에서 샘플의 염료를 흥분 nm 및 형광 스펙트럼 측정 670에서 800 nm nm. 이것은 수락자의 농도 측정 하입니다.</li>
	<li>3 샘플, 합성 되 고 별도로 정화는 같은 실험을 반복 하 여 표준 편차를 얻을.</li>
	<li>무서 워 효율성 비율21아래 방정식에 의해 설명 된 대로 메서드를 계산 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> 다550: 기증자와 수락자 550 nm 여기에서 샘플의 수락자 피크 형광 강도. D550: 550 nm 여기에서 기증자 전용 샘플의 수락자 방출 범위에서 형광 강도. 다650: 기증자와 수락자 650 nm 여기에서 샘플의 수락자 피크 형광 강도.</li>
</ol>

<ol>
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저자 공개할 게 없다

이 프로토콜은 디자인, 시뮬레이션, 합성, 그리고 기본적인 2D DNA 아코디언 랙의 분석에서 전체 과정을 소개합니다. 수정 된 설계 및 시뮬레이션 규칙 있다 설명 디자인 규칙의 표준 DNA 종이 접기, 다르기 때문에 DNA 아코디언 랙 추가 뉴클레오티드 유연성14,15크로스 오버에서. 이것에서 우리는 프로토콜 DNA 아코디언 선반을 사용 하 여 다양 한 연구를 가?...

그들은 생산을 나노미터 2D 및 3D의 복잡 한 나노 모션 때문에 DNA nanostructures 또는 DNA 빠져나가기1,2,3,,45 에 따라 기계 시스템 독특합니다. ångström 해상도, 다양 한 바이오 자극2,,36에 따르면. 이러한 구조에 기능성 소재를 연결 하 고 그들의 위치를 제어,이 구조는 다양 한 분야에 적용할 수 있습니다. 예를 들어 DNA 빠져나가기를 분자 원자로7, 마약 배달8및 nanoplasmonic 시스템9,10에 대 한 제안 되었습니다.
이전에 우리는 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 요소11 (그림 1A)의 2D 또는 3D 나노 네트워크를 조작할 수 있는 도입. 단지 몇 가지 요소를 제어 하는 다른 DNA 지지, 달리 플랫폼 공동으로 다양 한 단계에 주기적으로 기준점과 2D 또는 3D 요소 조작할 수 있습니다. 우리는 프로그래밍 가능한 화학 및 생물 반응 네트워크 또는 분자 컴퓨팅 시스템 건축 될 수 있다 우리의 시스템에서 관리할 수 있는 요소의 수를 늘려 예상. DNA 아코디언 랙 여러 DNA 광선의 네트워크가 단일 가닥 DNA (그림 1B)의 구성 된 관절에 연결 되어 있는 구조입니다. 아코디언 랙 DNA 빔에 의해 생성 된 DNA 자물쇠 광선의 스티커 부분에 교배 하 고 브리징 부분의 잠금 (잠금된 상태)의 길이 따라 빔 사이의 각도 변경 하 여 다시 구성 됩니다. 또한, 다단계 재구성은 DNA 가닥 발 기반 변위12,13자물쇠를 분리 하 여 자유 상태의 형성 후 새로운 자물쇠를 추가 하 여 보여 줍니다.
이 프로토콜에서 우리는 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 전체 설계 및 합성 과정을 설명합니다. 프로토콜 설계, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험, 및 6에 의해 6 메시의 DNA 아코디언 랙 및 이러한 재구성의 합성에 대 한 분석을 포함 한다. 프로토콜에서 설명 하는 구조는 이전 연구11 의 기본 모델 이며 65 nm 65 여 14 빔으로 구성 된 크기에 nm. 설계 및 시뮬레이션, 아코디언 랙의 구조 설계는 기존의 DNA 종이 접기14,15 (즉, 단단히 포장)에서 다르다. 따라서, 설계 규칙 및 분자 시뮬레이션 전통적인 방법에서 수정 되었습니다. 설명 하기 위해, 우리는 caDNAno14 의 수정 된 접근 및 아코디언 랙 추가 스크립트 oxDNA16,17 를 사용 하 여 시뮬레이션을 사용 하 여 설계 기법을 보여줍니다. 마지막으로, 구성 된 아코디언 랙 구조 분석에 대 한 가장 및 무서 워 두 프로토콜 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

DNA nanostructure 기반 기계 시스템 또는 ångström 해상도를 나노미터 2D 및 3D의 복잡 한 나노 모션 생성, DNA 빠져나가기 약물 전달, 분자 원자로 등 나노기술의 다양 한 분야에서 큰 잠재력을 표시 그리고 nanoplasmonic 시스템입니다. 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 수 총칭 조작 요소, 2D 또는 3D 나노 네트워크 응답 DNA 입력으로 여러 단계에서를 설명 합니다. 플랫폼은 DNA 빠져나가기 재구성의 여러 단계와 네트워크 규모에 몇 가지 요소에서 제어할 수 있는 요소 수를 늘릴 가능성이 있다.
이 프로토콜에 우리는 6에 의해 6 메쉬 재구성 가능한 DNA 아코디언 랙 전체 실험 과정을 설명합니다. 프로토콜 구조와 합성 및 재구성에 대 한 젖은 실험실 실험의 설계 규칙 및 시뮬레이션 절차 포함 되어 있습니다. 또한, 가장 (전송 전자 현미경 검사 법)과 무서 워 (형광 공명 에너지 전달)를 사용 하 여 구조 분석 프로토콜에 포함 됩니다. 이 프로토콜에서 설명 소설 설계 및 시뮬레이션 방법을 연구원 추가 응용 프로그램에 대 한 DNA 아코디언 랙을 사용 하 여 도움이 됩니다.

설계 된 6 월 6 일에 의해 DNA 아코디언 랙 oxDNA16,17 에서 시뮬레이션 하 고 결과 그림 6에 표시 됩니다. 시뮬레이션 결과에서 구조 왜곡 없이 원하는 구조 형성은 확인 되었다.
그림 7 에서 가장 이미지는 2, 8, 13, 20 bp 길이의 잠금 구성 된 구?...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

우리는 디자인, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험 및 아코디언 랙 6으로 6 메시의 DNA의 재구성에 대 한 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

재구성 가능한 DNA 아코디언 랙의 설계 및 합성

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K 조회수.  Seoul National University. 우리는 디자인, 시뮬레이션, 젖은 실험실 실험 및 아코디언 랙 6으로 6 메시의 DNA의 재구성에 대 한 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

연구

화학

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

DNA 종이 접기에서 바이오 반응 로봇을 설계

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

생체공학

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

유전학

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

감지 응용 을 위한 무기 구조물의 DNA 종이접기 중재기 나노patterning

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

시험관 내 전사 및 분자 계산을 위한 DNA 테더드 RNA 폴리머라제

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

플라스미드 유래 구현 화학 반응 네트워크 용 DNA 가닥 변위 게이츠

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...