도움을 청하기 위해 Karyn Esser, Nobuya Koike, Noeon Park에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 NIH / NIGMS (R01GM114424)가 S.-HY에, Robert A. Welch Foundation (AU-1731)과 NIH / NIA (R01AG045828)가 ZC

동물 보호는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 수행되었으며, 절차는 휴스턴에있는 텍사스 보건 과학 센터의 승인을받은 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 가교 골격근에서의 핵 분리 <ol><li> 이전에 자세하게 설명 된 바와 같이, 약 20 주령의 C57BL / 6 수컷 마우스에서 단리 된 뒷다리 골격 근육을 체중을 줄이고 빙냉 인산 완충 식염수 (PBS)에서 말린 것. 참고 : 우리는 일반적으로 하나의 마우스에서 1.0 - 1.5 g의 골격근을 얻습니다. <ol><li> 얼음에 10 ML PBS를 포함 50 ML 원추형 튜브에 다진 골격 근육 조직을 놓으십시오. </li></ol></li><li> 4 X에서 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. </li><li> 조심스럽게 흡인으로 PBS 상등액을 제거합니다. </li><li> 1, 2, 3 및 4 mL의 물을 가진 참조 튜브를 사용하여 각 50 mL 튜브의 펠릿 체적을 측정합니다. </li><li> 7 권 추가빙냉 된 1 % 포름 알데히드를 PBS에 넣고 프로브 조직 균질기를 사용하여 얼음 위에서 시료를 균질화합니다 ( 표 2 참조). 참고 : 선택 사항 : 균질화 절차는 차가운 방에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 분간 배양하여 샘플을 교차 결합시킨다. </li><li> 1 M 글리신을 0.125 M의 최종 농도로 첨가하여 가교 결합 반응을 켄 칭하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 포부를 통해 상징액을 제거하십시오. </li><li> 새로 첨가 된 프로 테아 제 억제제 (0.2 mM 페닐 메틸 술 포닐 플루오 라이드 (PMSF))를 함유하는 얼음 - 차가운 염기 완충액 (pH 7.3의 10 mM HEPES-KOH, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT) , 및 10 μg / mL leupeptin). 4 ℃에서 5 분간 3,000 g으로 원심 분리하고주의 깊게 흡인에 의해 상등액을 제거한다. </li><li> 6 ML의 용해 버퍼 (10 MM HEPES-KOH에서 p에서 펠렛을 Resuspend새로 첨가 된 프로테아제 억제제 (0.2 mM PMSF, 10 μg / mL leupeptin)가 포함 된 2 차 항체 (H 7.3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM DTT, 1 % Triton X- </li><li> prechilled 15 ML Dounce 호모 제 나이저에 샘플을 전송하고 얼음에 10 분 동안 품어. 핵을 해제하기 위해 꽉 유봉과 15 스트로크 다음 느슨한 유봉을 사용하여 15 슬로우 스트로크와 얼음에 각 샘플을 균질. </li><li> 셀 스트레이너 (기공 크기 : 100 μm)를 통해 균질 액 (6 mL)을 여과하고 4 mL의 용해 완충액으로 헹구십시오. 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 얼음처럼 차가운 염기 완충액 5 mL에 Resuspend하고 단단한 유봉으로 핵을 방출하기 위해 10 회 dounce합니다. <ol><li> 분광 광도계 (OD260 / OD280)로 DNA 농도 측정을 위해 20 μL의 분취 량을 제거하고 필요한 경우 트리 판 블루로 현미경으로 관찰합니다 (아래 참조) ( 그림 1A ). </li></ol></li><li> 서스펜션을 통해 필터링셀 스트레이너 (기공 크기 : 70 μm), 튜브를 헹구고 상기와 같이 2 mL베이스 완충액으로 다시 여과한다. </li><li> 점차적으로 감소 된 구멍 크기 (40 μm, 30 μm, 20 μm 및 10 μm)의 세포 여과기로 단계 1.13 에서처럼 여과를 반복하십시오. 참고 : 총 6 개의 구멍 크기의 여과기가 1.12-1.14 단계에서 사용되었습니다. </li><li> 4 ℃에서 1,000g에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는을 제거하고 500 μL 기본 버퍼에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 위와 같이 DNA 농도를 측정하십시오. 참고 : 한 동물의 두 가지 뒷다리를 결합하여 약 200 μg의 핵 DNA를 얻었습니다. 선택적으로 트리 판 블루 얼룩 (재고 농도 0.4 %, 1시 5 분 희석)과 현미경 관찰 20 μL 저장; 핵은 파란색으로 얼룩지게됩니다 ( 그림 1B ). </li><li> 4 ℃에서 1,000g에서 10 분간 원심 분리하고 상등액을 버린다. -80 ° C에 저장 펠렛. </li></ol> 2. 초음파 처리 &lt;ol&gt; <li> SDS 용해 버퍼 500 μL에서 샘플을 해동하고 부드러운 pipetting와 resuspend. </li><li> 얼음에 유리 바이알에 핵 DNA 현탁액을 전송합니다. </li><li> 접시 모양의 변환기에서 초음파 음향 에너지의 초점을 맞춘 버스트로 초음파 처리를 실행하십시오. 장비 세부 사항은 표 자료 를 참조하십시오. 다음 설정을 사용하십시오 : 버스트 당 사이클 : 200; 강도 : 5; 듀티 사이클 : 20; 온도 4 - 6 ° C; 30 초 온 / 오프. 참고 : sonication 효능을 평가하는 예제가 그림 2에 나와 있습니다. </li><li> sonicated 염색질을 1.5 ML 튜브로 전송하십시오. 15 분 12,000 XG에서 원심 분리기 및 새로운 튜브로 뜨는을 전송하십시오. 65 ° C에서 하룻밤 역방향 crosslinking위한 새로운 1.5 ML 튜브에 sonicated 샘플 (~ 7-10 μg / 근육 샘플) 50 μL를 전송합니다. -80 ° C에서 나머지 샘플을 고정 시키십시오. </li></ol> 3. 초음파 및 정량 평가 <ol><li> 1.0 추가보존 50 μL sonicated 샘플에 RNase A (500 U / ML RNase A : 20,000 U / ML RNase T1) μL과 37에서 30 분 품어 ° C. </li><li> 프로 테아 제 K (10 MG / ML) 8 μL를 추가하고 55에서 30 분 품어 ° C. </li><li> DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 수확하십시오. <ol><li> 결합 버퍼 5 부피를 추가하고이를 회전 컬럼에 가하고 4,000 xg, 10 분간 원심 분리한다. </li><li> 패스 스루를 같은 컬럼에 넣고 다시 원심 분리하십시오. </li><li> 13,000 xg, 1 분에 2 회 세척 완충액으로 씻으십시오. </li><li> 13,000 xg, 1 분에 다시 원심 분리하여 컬럼을 건조시킨다. </li><li> H 2 O 50 μL를 넣고 13,000 xg에서 1 분간 원심 분리하여 DNA를 용리한다. </li><li> 패스 스루를 같은 컬럼에 넣고 다시 원심 분리하십시오. </li></ol></li><li> 분광 광도계 (OD260 / OD280)로 DNA 양을 정량하십시오. 초음파 처리 된 제품 ( 그림 2 )의 크기와 양 (1 μg)을 평가하기 위해 0.8 % 젤에서 샘플을 실행하십시오. 참고 : 평균 염색질 수율은 약 ~ 20 %입니다. </li></ol> 4. 칩 <ol><li> 이전에 저장된 염색질을 -80 ° C에서 녹이고 튜브 당 ~ 100 - 120 μg로 염색질을 분액합니다. 방사 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼 (20mM 트리스 -HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 (PIC), 0.1 % Na- 데 옥시 콜레이트 w / v), 1 % 트리톤 X-100). <ol><li> 각 그룹에 여러 개의 샘플이있는 경우, 같은 양의 염색질 DNA를 ~ 100 - 120 μg / sample의 최종 양으로 합치십시오. 10 %를 입력으로 저장하십시오. </li></ol></li><li> BSA 사전 차단 (~ 2 시간, 4 ° C) 단백질 A / G 아가로 오스 (비 치킨 항체) 또는 IgY 비드 (치킨 항체) 40 μL (RIPA 완충액에 50 % v / v 슬러리)를 첨가하고 4 ° C에서 3 시간 동안 회전기. </li><li> 1,000 xg, 10 분에서 원심 분리기로 신중하게 상청액을 새 튜브로 옮긴다. </li><li> ~ 1 μg 항체 당 항체를 ~25 - 100 μg 염색질 DNA. </li><li> 4 ° C에서 약 15 rpm으로 하룻밤 부드럽게 회전시킨다. </li><li> BSA - 사전 차단 (~ 2 H, 4 ° C) 단백질 A / G 아가로 오스 (비 치킨 항체) 또는 IgY 구슬 (치킨 항체) 믹스 10 μL를 추가하고 차가운 방에서 2 시간 동안 회전합니다. </li><li> 구슬을 다음과 같이 씻으십시오. RIPA 완충액 1 mL 씩으로 2 회 3 분간 씻고 고염 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 % Triton X-100) 1 분간 LiCl 완충액 (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 250mM LiCl, 2mM EDTA, 1mM PMSF, 1 % Na- 데 옥시 콜레이트, 0.5 % NP40)로 3 분간 두 번 씻는다. <ol><li> 1 분간 Tris-EDTA (TE) 완충액 (10mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA)으로 3 분간 씻는다. 그런 다음 용리 완충액 (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA 및 0.5 % SDS)으로 DNA를 용리한다. </li></ol></li><li> 1,000 g에서 1 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상층 액을 제거한다. </li><li> 용리 버퍼 50 μL로 비드를 Resuspend. </li><li> 10 시간 동안 품어 라.65 ℃에서 분. </li><li> 5 분 동안 12,000 g에서 원심 분리하십시오. </li><li> 새 튜브에 뜨는을 전송, 또 다른 50 μL를 추가하고 5 분 12,000 g에 다시 한번 원심 분리기. 최종 용리 부피는 100 μL입니다. </li><li> 역 가교 결합 및 DNA 용리. <ol><li> 65 ° C에서 밤새 용리 된 염색질을 배양한다. </li><li> 37 ℃에서 30 분 동안 배양하고 RNase A 1.0 μL를 첨가한다. </li><li> 프로 테아 제 K (10 MG / ML) 8 μL를 추가하고 55에서 30 분 품어 ° C. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 50 μL에서 용출 볼륨과 PCR 청소 키트를 사용하여 DNA를 수확. </li></ol></li><li> 이전에 설명한대로 실시간 qPCR로 프로파일을 분석하십시오 25 , 26 . 참고 : 프라이머 서열은 그림 3 범례에 나와 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다 ( 그림 3 ). </li></ol>

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여기서 우리는 가교 결합 된 골격 근육 조직이 고품질의 핵을 분리하는 데 사용되는 견고한 방법을 설명합니다. 순차적 인 여과가 파편으로부터 핵을 효과적으로 분리하기 위해 수행되었고, 접시 형 변환기의 초음파 음향 에너지가 ChIP 분석을 위해 염색질을 전단했다. 그 결과는 표적 프로모터에 BMAL1의 24 시간 특정 결합을 보여 주었다. ChIP는 가교 결합이 일어날 때 게놈 DNA?...

골격근은 생리학 및 행동에 중요한 역할을합니다. 다핵 근섬유는 액틴과 미오신이 수축력을 생성하는 근육 절개 (sarcomeres)라고 불리는 기능 단위를 형성하는 근원 섬유 (myofibrils)로 구성됩니다. 골격근은 체내에서 가장 큰 대사 기관이기도하며, 식후 80 %를 초과하는 포도당 섭취량과 인슐린 반응과 대사 항상성을 조절합니다 1 , 2 . 근육 생리와 신진 대사는 24 시간 내내 시계에 의해 밀접하게 조절되며, 본질적인 생물학적 타이머 인 3 , 4 , 5 , 6 . 예를 들어, 생체 시계 핵심 구성 요소 중 하나 인 Bmal1 의 골격 근육 특이 적 결실은 인슐린 저항성을 초래하고 골격근에서의 포도당 섭취를 감소 시켰으며 동물은 제 2 형 당뇨병을 발생시키는 것으로 밝혀졌습니다. 나는또한 골격근은 전신 대사 및 생리를 조절하기 위해 myokines를 분비하는 내분비 기관으로 점차 인식되고 있습니다. 골격근에서의 이러한 조절 기능을 완전히 이해하려면 역학 연구가 필요합니다. ChIP는 DNA 결합 단백질의 프로모터 모집을 묘사하는 강력한 접근법입니다. ChIP는 처음에 염색질 DNA 9 , 10 에서 뉴 클레오 솜 조직을 확인하기 위해 개발되었습니다. 포름 알데히드, 디메틸 설페이트 또는 자외선 조사 (UV) 11,12를 사용하여 다양한 방법으로 단백질과 염색질 DNA를 가교 결합시키는 것으로보고되었습니다. 포름 알데히드 교차 결합은 가장 일반적으로 사용되는 것으로, 염색질 구조와 DNA- 단백질 상호 작용을 보존합니다 9 , 13 , 14 . 교차 결합 크로마토 그래피in은 sonication에 의해 파쇄되고 관심의 특정 DNA 결합 단백질 15 , 16 에 대한 항체와 immunoprecipitated입니다. 최근 몇 년 동안 ChIP와 NGS가 결합 된 ChIP-sequencing (ChIP-seq)이 게놈 차원의 전사 인자 바인딩 17 을 조사하고 경우에 따라 시간 경과에 따른 동적 변화를 모니터링하기 위해 개발되었습니다 18 , 19 , 20 . 예를 들어 circadian ChIP-seq 연구는 circadian clock 구성 요소와 히스톤 마커의 게놈 결합의 고도로 조율 ​​된 서열을 밝혀 냈습니다.이 마커는 ~ 24 시간 circadian cycle 18 동안 일시적으로 정확한 유전자 발현을 유도합니다. 가장 많이 사용되는 ChIP 프로토콜은 연조직 ( 예 : 간, 뇌 등 ) 용으로 설계되었으며, 골격활 근육. 섬유가 풍부한 골격근을 균질화하고 고품질 핵 21을 분리하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 특히 교차 결합이 필요한 ChIP 실험의 경우 더욱 그렇습니다. 최근 근육 ChIP 연구 22에서 , 위성 세포는 근섬유로부터 분리되었고, 핵은 조직 소화를 포함하는 장기간의 절차를 통해 양 세포 유형으로부터 준비되었다. 격리 된 핵에서 포름 알데히드 가교 결합을 수행하기까지 전체 공정을 완료하는 데 약 3 시간이 걸렸습니다. 이 절차로 인해 근육 조직이 근육 조직을 효율적으로 균질화되지 못하도록 만들었으며 고품질의 핵을 생성 할 수 있었지만 조직 수집에서 핵 가교로의 상당한 시간 지연으로 인해 DNA가 변경 될 위험이 있습니다 - 단백질 상호 작용. 대조적으로, 대부분의 연구는 실시간 DNA-protei를 보존하기 위해 실험적 치료 또는 조직 수집 직후 가교 결합을 수행했다바인딩 12 . 가교 결합 이전의 핵 분리의 두 번째 단점은 전형적으로 3 ~ 4 시간 간격으로 발생하는 24 시간 샘플 수집과 같이 시간에 민감한 애플리케이션을 배제한다는 점입니다. 핵을 가교 결합시키지 않으면 절개 직후에 분리가 진행되어야하며, 시간이 경과 된 후에 가교 샘플을 함께 처리 할 수 ​​있으므로 실험 일관성이 향상됩니다. 미가공 골격근으로부터의 핵 분리에 대한 다른 프로토콜도보고되었다. 두 개의 연구는 잔류 근원 섬유 및 세포 잔해로부터 핵을 분리하기위한 구배 초 원심 분리의 사용을 기술하고있다 23 , 24 . 수크로오스 또는 콜로이드 성 구배 초 원심 분리가 미가 교 근육 조직에 효과적이지만, 본 발명자들의 실험에 의하면 가교 결합 후 구배 초 원심 분리가 세포를 세포로부터 분리 시키는데 실패했다그라디언트에 ebris. 따라서 우리는 가교 된 마우스 골격 근육 조직을 이용하여 고품질의 핵을 분리하는 절차를 개발했습니다. 그라디언트 초 원심 분리보다는 핵을 파편과 효과적으로 분리하기 위해 연속 여과 방식을 고안했습니다. 초음파 처리 후, 염색질 샘플은 표적 프로모터에 결합하는 BMAL1 단백질의 일주기 패턴을 나타내는 ChIP 연구에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 근육 조직에 대한 다양한 기계 연구에 광범위하게 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Anti-BMAL1 antibody</td><td></td><td></td><td>Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chicken IgY Precipitating Resin</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&amp;nbsp;Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Dounce tissue grinder</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 70 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 40 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 30 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 10 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 Focused-ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>Model S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>CCD Microscope Camera</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent Kit&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 염색질 DNA에 결합하는 단백질을 결정하는 강력한 방법입니다. 그러나, 섬유가 풍부한 골격근은 근원 섬유의 오염을 최소화하면서 고품질의 핵을 분리하는 기술적 어려움으로 인해 ChIP에 대한 도전 과제였습니다. 이전의 프로토콜은 가교 결합 전에 핵을 정제하려고 시도했는데, 이는 연장 된 핵 준비 과정 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 변화를 초래할 위험이있다. 현재의 프로토콜에서, 우리는 먼저 쥐에서 수집 한 골격 근육 조직을 교차 결합시키고, 조직을 다듬고 초음파 처리 하였다. 우리는 초 원심 분리가 교차 결합 된 근육 조직을 사용하여 근원 섬유에서 핵을 분리 할 수 ​​없다는 것을 발견했기 때문에 중요한 근섬유 오염이없는 고품질의 핵을 얻기 위해 순차 여과 절차를 고안했습니다. 우리는 초음파 장비를 사용하여 염색질을 준비하고, 항 -BALAL1 항체로 ChIP 분석을 실시하여 강력한 일사 항 결합유전자 발기인을 표적으로하는 BMAL1의 패턴. 이 여과 프로토콜은 cross-linked 골격근 조직으로부터 고품질의 핵을 분리하는 데 쉽게 적용 할 수있는 방법으로, 일주기 및 기타 시간에 민감한 연구에 일관된 시료 처리가 가능합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)과 함께, 우리의 방법은 골격 근육 기능에 초점을 맞춘 다양한 기계 및 게놈 연구를 위해 배치 될 수 있습니다.

여기에서는 실시간 DNA- 단백질 상호 작용을 보존하기 위해 조직 수집 직후에 포름 알데히드 가교 결합을 수행했습니다. 그러나, 우리는 핵 분리 23 , 24에 일반적으로 사용되는 자당이나 콜로이드 그라디언트가 근원 섬유에서 핵을 분리하는 데 효과적이지 않음을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 그 이유는 교차 결합이 ?...

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A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

a-filtration-based-method-preparing-high-quality-nuclei-from-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K 조회수.  University of Texas Health Science Center at Houston.  우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다. 

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

연구

생화학

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

의학

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

생물학

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Chromatin Extraction from Frozen Chimeric Liver Tissue for Chromatin Immunoprecipitation Analysis

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on host and/or pathogen chromatin. Chromatin preparation from tissues creates additional challenges that need to be overcome to obtain reproducible and reliable protocols comparable to those used for cell culture. Tissue disruption and fixation are critical steps to achieve efficient shearing of chromatin. Coexistence of different cell types and clusters may also require different shearing times to reach optimal fragment size and hinders shearing reproducibility. The purpose of this method is to achieve reliable and reproducible host chromatin preparations from frozen tissue (liver) suitable for both ChIP-qPCR and next generation sequencing (NGS) applications. We observed that the combination of liquid nitrogen tissue pulverization followed by homogenization leads to increased reproducibility compared to homogenization only, since it provides a suspension consisting mostly of dissociated single cells that can be efficiently sheared. Moreover, the fixation step should be performed under mild rotation to provide homogeneous crosslinking. The fixed material is then suitable for buffer-based nuclei isolation, to reduce contamination of cytoplasmic protein and pathogen DNAs and RNAs (when applicable), avoiding time-consuming centrifugation gradients. Subsequent sonication will complete nuclear lysis and shear the chromatin, producing a specific size range according to the chosen shearing conditions. The size range should fall between 100 and 300 nt for NGS applications, while it could be higher (300-700 nt) for ChIP-qPCR analysis. Such protocol adaptations can greatly improve chromatin analyses from frozen tissue specimens.

This protocol focuses on chromatin preparation from snap frozen tissues and it is suitable for Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) followed by either quantitative PCR analysis (X-ChIP-qPCR) or next generation sequencing approaches (X-ChIP-seq).

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) is a widely used technique to assess levels of histone marks and occupancy of transcription factors on ...

Multiome 10X 유전체학 분석을 위한 고품질 시료 전처리

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

저자 스포트라이트: 단일 세포 분석을 통한 생물의학 연구의 발전 

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

요약

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ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

세대와 인간의 INO80 염색질 리모델링 단지 및 서브 콤플렉스의 정화

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

칩 엑소 방법 : 가까운 자료 쌍의 정밀과 단백질 DNA 상호 작용을 확인

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단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

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