csBN-MS 기술의 개발을 위한 핵심 목표는 다양한 유형의 조직 및 장기의 플라즈마 멤브레인을 가로질러 신호 전이를 뒷받침하는 단백질 복합체의 조직 및 조립에 대한 포괄적인 접근을 얻는 것이었습니다. csBN-MS는 현재 특히 막 단백질과 관련하여 토착 단백질 복합체 및 하위 단위 조성을 분석하기 위한 가장 높은 해상도의 다기능성을 제공합니다. csBN-MS 기술은 설치류 뇌에서 막 단백질 어셈블리의 복잡한 혼합물을 분석하기 위해 개발되었지만 모든 유형의 생물학적 시료의 분석에 쉽게 적응될 수 있다.
우리의 방법의 주요 단계 중 하나는 젤 조각의 포함 및 슬라이스하기 전에 절단 평면에 올바른 정렬입니다. 이 분석의 해상도를 줄일 수 있기 때문에 찢어또는 젤을 압축하고 절단 평면에 기울어져 있지 않은 있는지 확인해야합니다. 우리의 csBN-MS 기술은 좋은 결과를 위해 중요한 몇 가지 실용적인 단계가 있습니다.
단순히 설명하는 것보다 해당 단계를 자세히 수행하는 방법을 보다 쉽게 표시할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 펌프에 의해 구동되는 교반 2 챔버 그라데이션 믹서를 사용하여 선형 또는 고가모 그라데이션 젤을 캐스팅하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전면 믹싱 챔버 및 저수지 챔버에 대한 솔루션을 준비합니다.
교반기를 시작하고 앞 챔버의 용액에 APS 30 마이크로리터와 2.5 마이크로리터의 TEMED를 추가합니다. 그런 다음 펌프를 시작하고 전면 밸브를 엽니다. 약 1분 후, 90마이크로리터의 APS와 5개의 마이크로리터를 저수지 챔버에 넣고 챔버 연결을 엽니다.
젤이 실온에서 적어도 24시간 동안 천천히 철저하게 중합하여 균일한 모공 크기 그라데이션을 생성하도록 허용합니다. 촉촉하게 유지되면 중합체 젤은 최대 1 주일 동안 섭씨 4도에서 똑바로 보관 할 수 있습니다. 다음으로, 단백질의 0.5 와 2.0 밀리그램 사이를 분리하기 위한 유리 판 사이에 적절한 공간을 삽입하여 적재 슬롯을 준비합니다.
슬롯의 너비는 3cm 이상이어야 합니다. 버퍼를 실행하기 위해 50 밀리머 트리신, 50 밀리모어 비스 트리스 및 0.01 %의 Coomassie G-250으로 구성된 서있는 음극 버퍼를 준비하십시오. 50 밀리몰러 비스 트리스로 구성된 표준 양극 버퍼를 준비합니다.
약 2.5 밀리그램의 멤브레인과 2밀리리터의 용해도화 버퍼를 30분 동안 얼음에 1%의 비침하 세제를 함유하고 있습니다. 그런 다음 11 분 동안 130, 000 배 G에서 초원심 분리기. 1시간 동안 400G, 000배의 초원심분리로 짧은 50%20%의 자당스 스텝 그라데이션에 용해제를 농축합니다.
그 후, 튜브의 바닥에서 자당 그라데이션을 수확하고, 0.05%의 쿠마시 G-250을 용해성염에 넣고, 젤에 샘플을 적재한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 3단계 전압 프로토콜을 사용하여 하룻밤 사이에 10도에서 사전 BN-PAGE를 실행합니다. 젤이 실행 된 후 유리 판 사이에 유지하면서 문서화 목적으로 젤을 스캔합니다.
젤 분리의 품질을 검사합니다. 다음으로, 판을 분리하고 관심의 차선 섹션을 소비. 30%에탄올과 15%의 아세트산으로 차선을 30분 이상 두 번 수정합니다.
중간 을 포함 시료를 옮기고 멜슬래브를 궤도 셰이커에 슬로우 모션으로 유지하면서 적어도 2시간 동안 담그고 평형화할 수 있도록 합니다. 그런 다음 고정 젤 레인을 단백질 마이그레이션 전면 또는 밴드 패턴과 정확히 평행한 섹션으로 잘라냅니다. 각 섹션을 동일한 차원의 플라스틱 필름 지지에 배치하여 취급이 용이합니다.
차선을 맨 아래에 닫고 중앙에 천포처리된 스토퍼가 있는 열린 튜브로 이동하여 젤 섹션의 상하쪽과 하부와 정확하게 정렬됩니다. 실린더를 액체 질소에 잠깐 찍어 신속하게 응고를 시작하십시오. 투명 한 포함 매체는 몇 초 이내에 고형화 하 고 색상흰색이 된다.
캐비티를 중간 크기로 채우고 실린더를 액체 질소에 잠깐 담근 다음 몇 시간 동안 영하 20도에서 철저히 얼립니다. 분해 후 플라스틱 필름을 제거하고 임베디드 젤 섹션으로 블록을 냉각 된 금속 실린더로 옮김합니다. 실린더는 직경이 크고 중간을 포함하여 외부에 밀봉됩니다.
그것은 평면 지원에 배치됩니다. 실린더를 중간 크기로 채우고 앞에서 언급한 대로 철저히 동결하십시오. 이 절차를 실린더의 다른 쪽과 함께 반복하여 코플러너 바닥 표면이 있는 솔리드 블록을 얻습니다.
그런 다음 실린더에서 블록을 제거하고 중간을 포함하여 미리 냉각된 금속 홀더에 붙입니다. 금속 홀더를 냉동 기계에 삽입합니다. 홀더는 슬라이스 평면에 대해 신중하게 정렬해야합니다.
블록이 슬라이스 공정에 대해 최적의 온도로 평형화되도록 합니다. 이 수확 후 젤은 0.25 밀리미터의 최종 원하는 두께로 차례로 슬라이스하고 낮은 단백질 결합 특성을 가진 반응 튜브로 개별적으로 전달합니다. 그런 다음, 슬라이스는 트립틱 다이제스트 및 질량 분광 분석을 받게 됩니다.
이 프로토콜은 저분단백질을 발현하는 비미토콘드리아 막에 고해상도 안성 프로파일링의 적용을 확장합니다. 복잡한 분리는 매우 작은 이동 유물과 강하게 얼룩진 단백질 밴드를 보여줍니다. 질량 및 유지 시간에 펩티드 신호의 편차는 거짓 양성 피크 볼륨 할당에 대한 매우 낮은 속도를 나타냅니다.
최대 볼륨 데이터 집합의 다시 배율을 조정하여 실행-투-런 변형을 쉽게 제거할 수 있습니다. 결과 펩티드 강도 정보는 상대적 풍부의 2545 단백질 프로파일을 재구성하는 데 사용됩니다. 단백질 복합체의 분해를 위한 겔 샘플링 단계 크기의 관련성은 인접한 슬라이스의 데이터 집합에 가입하여 평가되었다.
0.25 밀리미터에서, TPC1 관련 복합 인구의 크기 분리는 서쪽 얼룩 분석결과와 잘 일치합니다. 두 개 이상의 슬라이스의 결합은 TPC1 복잡한 하위 인구의 차별을 폐지합니다. 마지막으로, 분석은 잘 특징짓는 단지에 대한 정보를 제공하고 새로운 하위 단위및 복잡한 어셈블리의 존재를 보여줍니다.
페리틴의 경우 상대적 풍요로움을 위해 조정된 서브유닛 프로파일은 뚜렷한 중형/라이트 체인 스토이치오메트리를 가진 적어도 세 개의 복잡한 동소형의 존재를 시사합니다. 대조적으로, nicalin-nomo1 복합체, 감마-분비 코어 복합체 및 GPI-transamidase 기계는 전체 크기 범위에 걸쳐 그들의 핵심 서브 유닛의 고정 된 풍부 비율을 보여주고 추가 단백질과의 연결에서 독립적. csBN-MS 분석의 주요 매개 변수는 샘플 생화학, BN 젤 품질, 포함 및 슬라이스 중 적절한 정렬, 획득 된 MS 데이터의 품질에 의해 결정되는 복합체의 효과적인 해상도입니다.
단백질과 시료의 동위원소 라벨링으로 csBN-MS를 빗질하면 다양한 병리학적, 생물학적 또는 발달 상태에서 복잡한 을 직접 비교할 수 있습니다. 설치류 뇌의 멤브레인에서 수행된 csBN-MS는 아체유닛 구성 및 기능에 대한 수용체, 이온 채널 및 수송기의 엄청난 다양성을 밝혀냈으며, 네이티브 제제에서 3D 구조를 분석하는 데 도움이 될 것입니다.
