이 작품은 동유럽 2007-2013의 운영 프로그램 개발에 따라 유럽 지역 개발 기금에서 유럽 연합 (EU)에 의해 지원되었다 (POPW.01.03.00-06-003/000), 루블린의 존 폴 II 가톨릭 대학의 생명 공학 및 환경 과학 학부에 의해 (일론사사옥에 대한 젊은 과학자 보조금), 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 국립 과학 센터, 폴란드 OPUS13 (막달레나 스타니스제프스카, 원칙 조사관에 대한 OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198)  저자는 산화 스트레스 연구소에서 교수 Agnieszka Şcibior 감사, 학제 간 연구 센터, 세포 배양 및 단백질 정량화를위한 장비를 공유하기위한 JPII CUL.

1. 표준 3NT, 킨, 3HKyn, 3HAA, XA 표준 재고 솔루션의 준비
<ol><li>가장 높은 정확도 (각각 0.3 mg)로 바이알에서 시약을 계량합니다. 더 나은 정확도를 위해 시약을 확장하여 1.2 단계에 따라 용매의 부피를 조정합니다.</li>
	<li>시약을 용매의 300 μL로 용해하여 물에서 1g/L의 스톡 용액을 1% (v/v) 포믹산(FA)으로 용해하는; 동전 설플옥화물 (DMSO)에서 킨, 3HAA 및 XA; 3HKyn은 염산(HCl)으로 pH 2.5로 산성화하였다. 주의: 3HAA는 눈, 코, 인후 및 폐를 자극합니다. 흡입시, 피부와 접촉하고 삼킨 경우 는 유해합니다. 장갑과 마스크와 같은 적절한 보호 기능을 착용하십시오.</li>
	<li>유리병을 단단히 닫고 용해를 가속화하기 위해 1 분 동안 초음파 욕조에 놓습니다. 참고: 재고 용액을 -20°C에 저장하고 재고 솔루션의 불안정성으로 인해 동결/해동(최대 3사이클)을 최소화합니다.</li>
</ol>2. 숯처리문화배지 준비
<ol><li>튜브에서, 280 mg의 활성 탄을 계량하고 관심있는 세포를 배양하기 위해 준비된 액체 배지의 5 mL을 추가합니다.</li>
	<li>상온에서 2시간 동안 톱 록커를 보고 중간 및 숯으로 튜브를 흔들어 주세요(50μg/분으로 설정). 다음으로, 15 분 동안 6000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 튜브를 제거하고 퇴적물을 방해하지 않고 상퍼를 조심스럽게 수집합니다. 필요한 경우 원심분리를 반복하여 모든 숯 잔류물을 제거합니다.</li>
	<li>0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다.</li>
	<li>6.3.2 단계에서 설명된 바와 같이 LC-MS에서 파일럿 샘플을 실행하여 숯 전처리 된 배양 배지가 kynurenines 흔적을 박탈당하는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 2.1-2.4 단계를 반복하십시오. 참고: 완전한 배양 배지가 처음에는 키누레닌을 포함하지 않으면 숯을 이용한 정화 단계가 생략될 수 있습니다. 이 경우 일반적으로 세포 배양에 대해 준비된 전체 매체를 사용하여 교정 표준 및 품질 관리 샘플을 준비합니다.</li>
	<li>분석될 때까지 준비된 매체를 4°C로 저장합니다.</li>
</ol>3. 교정 솔루션 및 교정 곡선 만들기
<ol><li>0.1 g/L 3NT 용액의 0.75 μL로 숯 전처리 배양 배지를 스파이크하고 적어도 6개의 서로 다른 농도(3HKyn, 3HAA, Kyn, XA)를 추가하여 교정 범위를 커버합니다. 각 샘플의 최종 부피를 150 μL. 소용돌이에 잘 보관하십시오. 샘플 준비를 위해 1.5mL 원심분리기 튜브를 사용합니다. 참고: 3HKyn에 대한 권장 교정 포인트: 0.018, 0.045, 0.22, 1.12, 2.23, 4.46 μmol/L; Kyn: 0.0096, 0.048, 0.24, 1.20, 2.40, 3.84 μmol/L; 3HAA: 0.033, 0.16, 0.65, 3.27, 6.53, 13.06 μmol/L; XA: 0.019, 0.13, 0.49, 1.22, 3.65, 4.87 μmol/L.</li>
	<li>150 μL의 차가운 메탄올(-20°C)을 첨가하여 1%(v/v) 포름산을 함유하여 각 튜브에 첨가하여 시료 탈단백질화를 한다. 튜브와 소용돌이를 단단히 닫습니다.</li>
	<li>샘플을 -20°C에서 40분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4°C에서 15분 동안 14,000 x g의 샘플을 원심분리합니다. 원심분리기에서 튜브를 제거합니다. 새로운 튜브에 슈퍼 네이츠를 수집합니다. 퇴적물을 방해하지 마십시오.</li>
	<li>자동 파이펫을 사용하여 상류체의 270 μL을 유리 바이알로 옮킨다. 바이알을 증발기에 넣고 건조할 때까지 부드럽게 증발합니다. 휘발성 성분을 증발시키기 위해 물/메탄올 분획에 적합한 프로그램을 사용합니다. 40°C 이상의 온도를 적용하지 말고 과다 건조를 피하십시오. 참고: 평평한 바닥 유리 바이알, 즉 크로마토그래픽 바이알은 플라스틱 원추형 튜브에 비해 더 빠른 증발과 더 높은 회수를 용이하게 합니다.</li>
	<li>30분 후 증발 상태를 확인합니다. 필요한 경우 증발을 계속합니다(예: 10분 추가). 과다 건조를 피하십시오.</li>
	<li>증발기에서 바이알을 제거합니다. 물 에서 0.1 % (v /v) 포믹 산의 60 μL에서 각 샘플을 재구성합니다. 잔류 재질을 포함하는 유리병에 용매를 추가합니다. 유리병과 소용돌이를 단단히 닫습니다.</li>
	<li>샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 침전된 단백질을 분리하기 위해 4°C에서 15분 동안 14,000 x g에서 회전합니다.</li>
	<li>단백질 펠릿을 방해하지 않고, 자동 파이펫으로 원추형 유리 인서트와 크로마토그래픽 바이알로 슈퍼네틱제를 전송합니다. 바이알을 단단히 닫습니다.</li>
	<li>삽입 유리병에 기포의 존재를 확인하고 필요한 경우 제거 (예를 들어, 소용돌이에 의해).</li>
	<li>샘플을 포함하는 크로마토그래픽 바이알을 LC 자동 샘플러로 옮는다. 자동 샘플러 트레이에 배치된 샘플의 위치를 기록합니다.</li>
</ol>4. 품질 관리 (QC) 샘플의 준비
<ol><li>0.1 g/L 3NT 용액의 0.75 μL과 4개의 키누레닌(3HKyn, 3HAA, Kyn, XA)의 기준을 교정 곡선의 선형 범위에서 선택된 한 농도로 숯 전처리 배양 배지(1.5ml 원심 튜브로 제조)를 스파이크한다. 샘플의 최종 부피를 150 μL로 유지합니다. 참고: 해당하는 경우 교정 곡선의 선형 범위 아래에 속하는 다양한 농도로 여러 QC 샘플을 준비합니다.</li>
	<li>섹션 3에 설명된 프로토콜을 따릅니다(3.2-3.11 단계).</li>
</ol>5. LC-MS 시스템 설정
<ol><li>이동상 용매 준비: 용매 A: 20 mmol/L 암모늄 초순수(pH 4.3+ 산으로 조정); 용매 B : 100 % 아세토나이트. 참고: 보로실리케이트 유리병만 사용하세요. 병을 초순수물로 헹구고 다시 채웁니다. 세제로 청소한 병을 사용하지 마십시오. 주의: 아세토나이트는 심각한 건강 효과 나 사망을 일으킵니다. 그것은 쉽게 열에 의해 점화된다. 아세토닐리액과 증기는 눈, 코, 인후 및 폐를 자극할 수 있습니다.<ol>
<li>유리병에 초순수 50mL로 결정성 시약(15.77g)을 용해시켜 암모늄 용액 5몰/L 스톡 용액을 준비한다. 모든 잔류가 녹을 때까지 저어줍니다. 0.45 μm 멤브레인을 통과하여 잔류 이물질을 제거합니다(예: 나일론 주사기 필터를 사용하여). 스톡 용액을 4°C로 저장합니다.</li>
		<li>호박색 유리 병에 초순수 980mL에 물에 5 mol/L 암모늄의 4mL를 첨가하여 용매 A를 준비하고 잘 저어줍니다. 교반 바를 침지하고 용매를 자기 교반기위에 놓습니다. pH 전극을 용액에 담그고 교반 하에서 pH를 제어합니다. 포믹산 재고 용액 추가(98%-100%) 0.2mL 팁의 자동 파이펫을 사용하여 pH 4.3을 얻고, 초순수 물로 최대 1L까지 볼륨을 조정하고 잘 저어줍니다. 참고: 어떤 미생물 성장을 방지하기 위해 적어도 일주일에 한 번 용매를 준비합니다. 주의: 포믹산(FA)은 흡입시 독성이 있어 피부 화상과 눈 손상을 유발합니다. 연기 후드 아래에서 작업; 보호 장갑과 코트를 착용하십시오.</li>
		<li>0.22 μm 멤브레인(예: 나일론 주사기 필터)을 통해 모든 솔루션을 필터링하여 잔류 이물질을 제거합니다. 선택적으로 LC 용매 저장소 전용 용매 입구 필터를 사용하여 들어오는 입자로부터 시스템을 보호합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>LC-MS 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다.</li>
	<li>모바일 단계로 LC 시스템을 제거하여 거품을 제거하고 모든 용매 채널을 프라임합니다.</li>
	<li>가드 열을 앙상블하여 분석 컬럼이 막힘으로부터 보호합니다.</li>
	<li>가드 및 분석 컬럼(C18, 2.1 x 100mm, 1.8 μm)을 약 30분 동안 100% 아세토나이트로 플러시한 다음, 열내의 안정적인 압력이 관찰될 때까지 100% 용매 A를 사용합니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 시스템 성능을 제어합니다.</li>
	<li>데이터 수집 소프트웨어에 적절한 LC 매개 변수를 설정합니다.<ol>
<li>그라데이션 프로그램 설정: 0-8분 용매 B 0%; 8-17 분 용매 B 0-2 %; 17-20 분 용매 B 2 %; 20-32 분 용매 B 10-30 %; 32-45 분 용매 B 0 %.</li>
		<li>이동상 유량은 0.15mL/min, 총 분석 런타임 45분, 기둥 온도 +40°C, 사출 부피 10μL로 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>질량 분석 검출기의 획득 매개변수를 설정합니다.<ol>
<li>이온화 파라미터 적용: 단일 이온 모니터링(SIM), 양성 이온화, 50psi의 분무기 압력, +350°C 건조 가스 온도, 12L/min의 건조 가스 흐름, 5500 V 모세관 전압.</li>
		<li>3HKyn m/z 225.0 (스캔 기간: 2-6분, 조각전압: 100 V);용, 3HKyn m/z 225.0의 경우, 문체 모니터링 이온을 선택합니다. Kyn m/z 209.0 (스캔 기간: 6-12 분, 조각 전압: 80 V); 3HAA m/z 154.0 (스캔 기간: 12-18 분, 단편전압: 80 V); 3NT m/z 227.0 (스캔 기간: 18-23 분, 조각전압: 100 V); XA m/z 206.0의 경우(스캔 기간: 23-45분, 조각전압: 100 V).</li>
	</ol></li>
	<li>작업 목록을 구성하고 LC 시스템에서 샘플을 실행합니다.</li>
	<li>처음에 실험 용 샘플을 분석하기 전에 적어도 삼중 시료(Solvent A)를 실행한 다음 하나의 QC 샘플을 실행합니다.</li>
	<li>데이터 분석 소프트웨어를 열고 QC 샘플에 대해 얻은 결과를 로드합니다.</li>
	<li>크로마토그램의 아나리테 봉우리 위치를 확인합니다. 신호가 예상 위치를 넘어 이동하면 적절한 단화 신호 수집을 위한 시간 게이트를 조정합니다. 신호 통합에 대한 지침에 대한 소프트웨어 설명서를 참조하십시오.</li>
</ol>6. 교정 곡선 구성
<ol><li>데이터 수집 소프트웨어에서 교정 표준을 작업 목록에 추가하고 트리클리케이트에서 표준을 실행합니다.</li>
	<li>3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT 및 XA에 대응하는 피크 영역을 각각 약 4.4분, 10분, 16분, 21분 및 30분의 유지시에 통합및 측정합니다.</li>
	<li>스프레드시트 프로그램을 사용하여 각 대사 산물에 대해 개별 교정 곡선을 구성합니다.<ol>
<li>교정 차트를 만들려면 분석물의 농도대비 3NT 피크 영역에 걸쳐 분석 피크 영역의 비율에 대한 값을 플롯합니다.</li>
		<li>빈 시료(3NT로만 스파이크된 숯전배배지)를 분석하여 배지에 연구된 분석물의 흔적이 없도록 한다. 그렇지 않으면 각 교정 지점에서 얻은 값을 뺍니다.</li>
		<li>각 교정 곡선의 선형성을 확인합니다.<ol>
<li>개별적으로, 각 분석물의 경우, 경사-가로채기 선형 방정식(y=ax+b)을 생성하여, 여기서 y는 분석피크 영역 대 3NT 피크 영역의 비율에 해당하며, a는 경사, x는 분석 농도(μmol/L)이며, b는 곡선 차단을 의미한다. 그래프 'y'와 'x'를 플로팅하면 보정 곡선이 생성됩니다.</li>
			<li>차트에 선형 추세선을 추가하고, 차트에 교정 곡선 방정식 및 회귀 계수를 표시합니다. 회귀 계수가 > 0.990인지 확인합니다. 일치하지 않는 교정 표준의 경우 다시 한 번 준비 및/또는 분석합니다. 선택적으로 보정 곡선의 농도 범위를 변경합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실험 샘플을 분석하기 전에 QC 샘플을 분석하여 시스템 성능을 확인합니다. 비호환성(기준값에서 ± 20% 편차)의 경우 새 교정 곡선을 준비합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 분석을 위한 체외 세포 배양 및 샘플 수집
<ol><li>DMEM에서 연구된 암세포(MDA-MB-231 또는 SK-OV-3)를 플레이트(DMEM(덜벡코의 수정독수리 의 매체)는 ᴅ 포도당의 4.5g/L을 함유하고, 10% (v/v) 태아 소 혈청 (FBS), 2 mmol/L ʟ 글루타민 과 1 U 페니실린 /연쇄 상색 및 문화 37 °C에서 5%CO2의 가습 된 분위기에서 실험을 확장한다. 결합의 80 %에서 세포를 통과.</li>
	<li>트립신을 이용한 배양 접시로부터 세포를 분리하고, 12웰 플레이트에 대한 실험을 위한 종자 당 0.3 × 106 세포의 밀도로 하룻밤 동안 인큐베이터에 배치된다.</li>
	<li>다음 날, 배양 배지를 흡인하고 실험 설계에 따라 연구된 화합물의 첨가 유무에 관계없이 신선한 DMEM을 첨가한다.</li>
	<li>48h 후, 세포 위(약 500 μL)에서 1.5mL 튜브로 배지를 수집한다. 14, 000 x g의 원심분리기는 5분 동안 세포 이물질을 제거합니다. 상체를 수집하고 분석 할 때까지 -80 °C에 저장합니다.</li>
	<li>단백질 추정을 위해 7.4 단계에서 세포 펠릿을 저장하십시오. 샘플을 -20°C에서 동결합니다. 참고: 다른 우물에서 배지에 대해 얻은 결과는 개별 우물의 세포 수의 가변성을 설명하기 위해 총 단백질 함량으로 정규화되어야 합니다. 단백질 농도는 9단계에서 설명된 바와 같이 평가될 수 있다.</li>
</ol>8. LC-MS 분석을 위한 샘플 준비
<ol><li>실온에서 냉동 샘플을 해동하고 잘 섞습니다. 배양 배지의 149.25 μL을 원심분리관(1.5mL)으로 옮긴다.</li>
	<li>3NT 용액의 0.1 g/L의 0.75 μL(내부 표준)을 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 잘 닫습니다.</li>
	<li>시료 단백질화를 위해 -20°C 메탄올1%(v/v) FA에서 150μL를 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 잘 닫습니다.</li>
	<li>섹션 3(3.3-3.11 단계)에 설명된 바와 같이 샘플 준비를 계속합니다. 참고: SK-OV-3와 같은 일부 암세포는 다량의 킨을 배양 배지로 분비합니다. 데이터를 보정 곡선의 선형 범위에 맞추기 위해서는 샘플의 약 100배 희석이 필요합니다. 이 경우, 물 에서 0.1% (v/v) FA로 샘플의 일부를 희석하고 희석되지 않은 시료 이외에 분석한다. 교정 곡선에 대한 표준의 기준 샘플은 100배 희석된 완전한 배양 배지로 제조되어야 합니다. 또는 교정 곡선에 더 많은 점을 추가하여(적절한 용해도 및 선성이 달성되는 경우) 실험 샘플에서 Kyn의 농도 수준으로 조정한다.</li>
	<li>5항에 설명된 바와 같이 LC-MS에 의해 샘플을 분석합니다. 작업 목록을 구성하고 각 샘플을 트리플리케이트로 실행합니다.</li>
	<li>작업 목록이 완료되면 aalyte의 피크 영역을 측정합니다.</li>
	<li>사용 가능한 소프트웨어와 얻어진 숫자 데이터를 사용하여 스프레드시트를 생성합니다.</li>
	<li>하나의 스프레드시트 열에서 3NT 피크 영역에 대한 분석 피크 영역의 비율을 계산합니다.</li>
	<li>각 해석물(단계 6.3.에서)에 전념하는 개별 선형 교정 방정식을 사용하여 실험 샘플에 존재하는 해석물의 농도를 계산합니다.</li>
</ol>9. 단백질 함량 및 데이터 정규화 평가
<ol><li>1.5mL 튜브에서 인산염 완충식염(PBS)의 100 μL로 7.5단계에서 세포 펠릿을 다시 분리한다. 참고: 염화나트륨 8g, 염화칼륨 0.2g, 인산나트륨 디베이직 1.44g, 칼륨 이산화수소 인산염 950mL를 녹여 PBS 용액을 준비한다. 잘 저어주세요. 염산 (드롭 와이즈)으로 pH를 7.4로 조정합니다. 초순수물로 최대 1L의 부피를 조절합니다. 균질할 때까지 잘 저어줍니다. 주의: 염산은 부식성이 매우 높으며 적절한 안전 예방 조치로 처리해야 합니다. 인간의 피부와의 접촉은 발적, 통증, 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 연기 후드 아래에서 작업; 보호 장갑과 코트를 착용하십시오.</li>
	<li>샘플을 -20°C에서 동결한 다음 얼음에 해동합니다. 이 단계를 3배 반복합니다.</li>
	<li>4°C에서 15분 동안 14, 000 x g의 시료원심분리. 새로운 튜브에 슈퍼 네이티퍼를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 마십시오.</li>
	<li>PBS로 수퍼네이트 10배희석.</li>
	<li>웰 범위당 단백질의 0에서 2 μg까지 교정 곡선을 구성합니다.<ol>
<li>교정을 위한 소 세럼 알부민(BSA) 표준 솔루션을 준비합니다. 1mL의 초순수와 소용돌이에 BSA 1.23 μg를 잘 녹입니다.</li>
		<li>96웰 플레이트에서 다양한 양의 BSA 표준 용액(1.23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL을 적재합니다.</li>
		<li>PBS로 우물을 50 μL의 최종 부피에 채웁니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부하 10 - 15 μL 셀은 동일한 96웰 플레이트의 9.4 단계에서 lysate합니다. 50 μL의 최종 부피에 도달하기 위해 PBS로 우물을 채웁니다. 참고: 필요한 경우 각 웰의 셀 리세이트 알리쿼트의 부피를 조정하여 교정 곡선의 선형 범위에 맞게 조정합니다. 최종 부피를 샘플당 50 μL로 유지합니다.</li>
	<li>브래드포드 시약200μL(초순수물로 희석5회)를 각 웰에 넣습니다.</li>
	<li>실온에서 최소 5분 동안 96웰 파테를 배양합니다. 접시를 마이크로 플레이트 판독기에 삽입합니다. λ = 595 nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>스프레드시트 프로그램을 사용하여 교정 곡선을 구성합니다. BSA 양(μg)과 흡광도를 플롯합니다. 선형 추세선을 추가하고, 차트에 교정 곡선 방정식 및 회귀 계수를 표시합니다.</li>
	<li>선형 방정식(y = ax +b, 여기서 y는 λ = 595 nm에서 흡광도에 해당하며, a는 경사이고, x는 단백질 함량(μg) 및 b가 곡선 차단을 의미하여 시료에서 단백질 양을 계산한다. 참고: 계산에서 샘플 희석 계수를 고려합니다.</li>
	<li>단백질 1 mg당 샘플에서 키누레닌 양을 정상화하기 위해 추정 된 단백질 함량을 사용합니다. 이를 위해, 8.9단계에서 결정된 키누레닌의 농도를 9.10단계에서 총 단백질 함량과 나눈다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDO1:+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment.">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li><li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology.">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li><li>Badawy, A. A. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li><li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity.">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine-2,3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways.">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li><li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites.">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li><li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC-MS/MS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites,+tryptophan,+monoamines+and+neopterin+in+plasma,+cerebrospinal+fluid+and+brain.">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li><li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li><li>M&#246;ller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan,+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma.">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li><li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites.">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li><li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection.">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li><li>Vignau, J., Jacquemont, M. 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K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum.">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75 (2017).</li><li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan,+kynurenine,+kynurenic+acid,+and+quinolinic+acid+in+human+plasma.">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li><li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization/mass+spectrometry.">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+LC-MS/MS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients.">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li><li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography/electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li><li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum,+urine,+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry.">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li><li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes.">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li><li>Sadok, I., Rachwa&#322;, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells.">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li><li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression+in+mass+spectrometry.">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li><li>Hou&#233;e-L&#233;vin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine:+An+update+on+mechanisms+of+formation,+advances+in+analysis+and+biological+consequences.">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li><li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2,+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage.">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , (2019).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes.">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416 (2009).</li><li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoleamine+2,3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins,+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens.">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li></ol>

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본 논문은 체외 배양 인간 암세포로부터 배지에서 측정되는 4개의 주요 Trp 대사산물(3HKyn, Kyn, 3HAA, XA)의 동시 정량화를 위한 상세한 LC-SQ 프로토콜을 제시합니다. 샘플 준비, 크로마토그래피/질량 분광법 절차 및 분석 에서 가장 중요한 점인 데이터 해석에 특별한 주의를 기울입니다.
일반적으로 LC-MS 분석은 높은 감도로 인해 사용되는 재료의 프로토콜 엄격성 및 순도의 ...

Kynurenine 통로 (KP)는 인간 세포에 있는 트립토판 (Trp) 이화작용의 주요 경로입니다. 외세포에서 인돌리아민-2,3-디산소효소(IDO-1)는 KP의 최초 및 제한 효소이며 Trp를 N-formylkynurenine1로변환한다. KP 내의 추가 단계는 다른 이차 대사 산물, 즉 다양한 생물학적 특성을 나타내는 kynurenines를 생성합니다. Kynurenine (Kyn)은 아릴 탄화수소 수용체 (AhR)2에결합 한 후 독성 특성 및 조절 세포 이벤트를 보여주는 최초의 안정적인 Trp catabolite이다. 그 후, 킨은 자발적으로 또는 효소 매개 공정에서 여러 분자로 변형되어 3-하이드록시키누레닌(3HKyn), 탄트라날산(AA), 3-하이드록산(3-HAA), 키누레닉산(Kyna), xanethurnicacid(Xanethurnic)와 같은 대사산물을 생성합니다. 또 다른 하류 대사 산물, 2 아미노산-3-카복시무코닉 산-6-세미알데히드(ACMS),퀴놀린산(QA) 또는 피콜리닉산(PA)1에비효소 순환화를 겪는다. 마지막으로, QA는 니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)3,중요한 효소 보조인인 KP 엔드포인트 대사산물로 더욱 변형된다. 일부 키누레닌은 키나와 PA와 같은 신경 보호 특성을 가지고 있으며, 다른 사람, 즉 3HAA 및 3HKyn은 독성4입니다. 3HKyn에서 형성되는 산투레닉 산은 항산화 및 혈관 완화 특성5를제시합니다. XA는 노화 렌즈에 축적되어 상피 세포의 세포멸각증으로이어진다 6. 20세기 중반에 설명된 KP는 다양한 장애에 대한 참여가 입증되었을 때 더 많은 관심을 얻었습니다. 이러한 대사 경로의 증가된 활동과 일부 키누레닌의 축적은 면역 반응을 조절하고 우울증, 정신 분열증, 뇌병증, HIV, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 말라리아, 알츠하이머병, 헌팅턴병 및 암4,7과같은 다른 병리학적 조건과 관련이 있다. Trp 대사의 일부 변화는 종양 미세 환경 및 암세포에서관찰된다2,8. 또한, kynurenines 유망한 질병 마커로 간주됩니다9. 암 연구에서, 체외 세포 배양 모델은 잘 확립되어 널리 항암제에 대한 반응의 전임상 평가에사용된다(10). Trp 대사 산물은 배양 배지로 세포에 의해 분비되고 kynurenine 통로의 상태를 평가하기 위하여 측정될 수 있습니다. 따라서 쉽고 유연하며 신뢰할 수 있는 프로토콜을 가진 다양한 생물학적 시편에서 가능한 한 많은 KP 대사산물의 동시 검출을 위한 적절한 방법을 개발할 필요가 있다.
이 논문에서, 우리는 4개의 kynurenine 통로 대사산물의 동시 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다: Kyn, 3HKyn, 3HAA 및 XA에 의하여 LC-SQ에 의하여 암세포에서 집합된 포스트 배양 배지에. 현대 분석 접근법에서, 액체 크로마토그래피(13,14,15,16)는 Ehrlich 시약11,12를활용한 생화학적 비특이적 분석과는 달리 개별 트립토판 이화산물의 동시 검출 및 정량화에 바람직하다. 현재, 주로 자외선 또는 형광 검출기13,17,18,19를가진 액체 크로마토그래피를 기반으로 인간 표본에서 키누레닌 결정에 사용할 수 있는 많은 방법이 있다. 질량 분석 검출기(LC-MS)와 결합된 액체 크로마토그래피는 높은 감도(검출의 하한), 선택성 및 반복성으로 인해 이러한 유형의 분석에 더 적합한 것으로 보입니다.
Trp 대사 산물은 이미 인간 혈청, 혈장 및소변(13,20,21,22,23)에서결정되었지만, 세포 배양 배지와 같은 다른 생물학적 표본에 대한 방법도 원하고 있다. 이전에는 LC-MS가 인간 신경교종 세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 인터페론 감마(IFN-γ)24,25,26으로처리된 성상세포를 배양한 후 수집된 배지에서 Trp 유래화합물에사용되었다. 현재, 암 모델에 사용되는 다른 배양 매체, 세포 및 치료에 있는 몇몇 대사산물의 평가를 허용할 수 있는 새로운 검증된 프로토콜을 위한 필요가 있습니다.
개발된 방법의 목적은 KP에서 이상을 나타낼 수 있는 4개의 주요 키누레닌(1개의 분석 실행 내)을 정량화하는 것입니다. 여기에 제시된 시험관내 배양 인간암세포(27)로부터수집된 배지에서 하나의 내부 표준(3-니트로티로신, 3NT)을 사용하여 선택된 의미 있는 kynurenines의 정량적 LC-SQ 분석을 위한 당사의 최근 발표된 프로토콜의 중요한 단계이다. 우리의 가장 좋은 지식에, 그것은 체외 성장 세포에서 얻은 배양 배지에서 3HKyn, 3HAA, Kyn 및 XA의 동시 정량화를위한 최초의 LC-SQ 프로토콜입니다. 일부 수정시, 방법은 세포 배양 모델의 넓은 범위에서 Trp 물질 대사의 변화를 연구하기 위해 더 적용 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1360px;" width="1359">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-hydroksy-DL-kynurenina</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">H1771</td>
			<td style="width:513px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-hydroxyanthranilic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">148776</td>
			<td>97%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">3-nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">N7389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>1.00029</td>
			<td>hypergrade for LC-MS LiChrosolv</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Activated charcoal</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td>05105</td>
			<td>powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:175px;">Ohaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:411px;">Analytical column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>959764-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2.1 x 100 mm, 1.8 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium formate</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">7022</td>
			<td>eluent additive for LC-MS, LiChropur, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>1001887398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Caps for chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>blue screw caps,PTFE/red sil sepa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>704004</td>
			<td>polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td style="width:175px;">Biologix</td>
			<td>07-6012</td>
			<td>12-well, non-pyrogenic, non-cytoxic, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>HERAcell 150i Cu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5415R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model 5428</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-2278</td>
			<td>Eppendorf type, 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>B-3693</td>
			<td>Falcon type, 50 mL, PP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic data acqusition and analysis software</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic insert vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-1387</td>
			<td>100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chromatographic vials</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5182-0714</td>
			<td>2 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">1.02950</td>
			<td>Uvasol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dubelcco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:175px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-41450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Dual meter pH/conductivity</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>SevenMulti</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evaporator</td>
			<td style="width:175px;">Genevac</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>model EZ-2.3 Elite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Formic acid</td>
			<td style="width:175px;">Supelco</td>
			<td style="width:261px;">5.33002</td>
			<td>for LC-MS LiChropur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Glass bottle for reagents storage</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>S-2070</td>
			<td>50 mL, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Guard column</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">959757-902</td>
			<td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Narrow Bore Guard Column (2.1 x 12.5 mm, 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.00317.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">L-kynurenine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">K8625</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:175px;">Wigo</td>
			<td style="width:261px;"></td>
			<td>ES 21 H</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microbalance</td>
			<td style="width:175px;">Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td>model XP6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Milli-Q system</td>
			<td style="width:175px;">Millipore</td>
			<td>ZRQSVPO30</td>
			<td>Direct-Q 3 UV with Pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadrupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>G1948B</td>
			<td>model 6120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Adrich</td>
			<td>048M4874V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:175px;">Bio Tek</td>
			<td></td>
			<td>Synergy 2 operated by Gen5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.05108.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td style="width:175px;">BioRad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">See-saw rocker</td>
			<td style="width:175px;">Stuart</td>
			<td>SSL4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipette</td>
			<td style="width:175px;">Nest</td>
			<td>326001</td>
			<td>5 mL, polystyrene, non-pyrogenic, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:175px;">Merck</td>
			<td>1.06346.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent inlet filter</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>5041-2168</td>
			<td>glass filter, 20 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6524</td>
			<td>1 L, clear glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solvent reservoir (for LC-MS)</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td>9301-6526</td>
			<td>1 L, amber glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet program</td>
			<td style="width:175px;">Microsoft Office</td>
			<td></td>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stir bar</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-2003</td>
			<td>teflon coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for culture medium filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>7-8803</td>
			<td>regenerated cellulose, &#216; 30 mm, 0,45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filters for mobile phase components filtration</td>
			<td style="width:175px;">Bionovo</td>
			<td>6-0018</td>
			<td>nylon, &#216; 30 mm, 0,22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>96-wells, sterille</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrih</td>
			<td>T4049-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:411px;">Ultra-High Performance Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:175px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:261px;">G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td>
			<td style="width:513px;">1200 Infinity system consisted of autosampler (G1367D), degasser (G1379B), binary pump (G1312B), column thermostat (G1316C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasound bath</td>
			<td>Polsonic</td>
			<td>104533</td>
			<td>model 6D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td></td>
			<td>model V-1 plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:261px;">D120804</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous quantification of selected kynurenines analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry in medium collected from cancer cell cultures

kynurenine 통로 및 kynurenines에게 불린 트립토판 이환산물은 면역 조절 및 암 생물학에 그들의 연루를 위해 증가한 관심을 수신했습니다. 체외 세포 배양 분석은 종종 질병 메커니즘에서 다른 트립토판 이환산물의 기여에 대해 배우고 치료 전략을 테스트하는 데 사용됩니다. 분비대사산물과 신호 분자가 풍부한 세포 배양 배지는 트립토판 대사 및 기타 세포 사건의 상태를 반영한다. 복합 세포 배양 배지에서 다중 키누레닌의 신뢰할 수 있는 정량화를 위한 새로운 프로토콜은 여러 시료의 안정적이고 빠른 분석을 가능하게 하고자 한다. 이것은 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피로 달성될 수 있습니다. 이 강력한 기술은 대사 산물의 정량화를 위한 많은 임상 및 연구 실험실에서 채택되고 kynurenines를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.
여기에 제시된 액체 크로마토그래피는 4개의 키누레닌, 즉 키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시키누레닌, 3-하이드록시스라놀릭 및 산의 동시 측정을 위한 단일 쿼드러폴 질량 분광법(LC-SQ)과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용한다. SQ 검출기는 사용하기 쉽고 다른 질량 분광계에 비해 저렴합니다. SQ-MS 분석에서, 샘플로부터의 다중 이온은 특정 질량대전비율(m/z)에따라 생성되고 분리되며, 그 다음에는 단일 이온 모니터링(SIM) 모드를 이용하여 검출한다.
이 백서는 보고된 방법의 장점에 주목하고 몇 가지 약점을 나타냅니다. 크로마토그래피 및 질량 분광분석과 함께 샘플 준비를 포함한 LC-SQ 분석의 중요한 요소에 초점을 맞추고 있습니다. 품질 관리, 방법 교정 조건 및 매트릭스 효과 문제도 논의됩니다. 우리는 모든 표적 마취에 대한 하나의 아날로그 표준으로 3 니트로티로신의 간단한 응용 프로그램을 설명했다. 인간 난소 및 유방암 세포를 이용한 실험에 의해 확인된 바와 같이, 제안된 LC-SQ 방법은 신뢰할 수 있는 결과를 생성하고 다른 체외 세포 모델에 더 적용될 수 있다.

LC-MS는 복잡한 표본의 일부 구성 요소가 소위 매트릭스 효과를 일으키고 분석물의 이온화를 손상시키더라도 생물학적 활성 분자의 정량화에서 명백한 이점을 제시합니다. 이온 억제 또는 이온 향상으로 이어지며 정확도를 강력하게 감소시키고 LC-MS의 검출/정량화 한계에 영향을 미치며, 이는 이 방법의 '약한" 지점으로 간주됩니다. 우리의 프로토콜에서, 이온은 또한 Trp 대사 산물 결정 에 대한 다...

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Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

여기에 설명된 항암세포 배양으로부터 수집된 배지에서 키누레닌 통로(kynurenine, 3-하이드록시키누레닌, 크산, 3-하이드록산, 3-하이드록산산)에서 생성된 4개의 상이한 트립토판 대사산물의 결정 프로토콜이 단일 사각폴 황색술과 결합된 액체 염색체 배양으로부터 수집된다.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

simultaneous-quantification-selected-kynurenines-analyzed-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.3K 조회수.  The John Paul II Catholic University of Lublin. 여기에 설명된 항암세포 배양으로부터 수집된 배지에서 키누레닌 통로(kynurenine, 3-하이드록시키누레닌, 크산, 3-하이드록산, 3-하이드록산산)에서 생성된 4개의 상이한 트립토판 대사산물의 결정 프로토콜이 단일 사각폴 황색술과 결합된 액체 염색체 배양으로부터 수집된다.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

연구

생체공학

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3 차원 세포 배양 모델의 질량 분석 이미징을위한 준비 전략 샘플

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

전통적인 담배 연기와 전자 담배 연 무질에서 액체 추출의 세대에 대 한 장치를 운영 하는 마이크로컨트롤러

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...