효모는 유전 연구뿐만 아니라 야생 유형 및 돌연변이 효모 균주에서 추출 한 단백질 및 기타 거대 분자의 생화학 연구를위한 인기있는 모델 유기체입니다. 그러나, 그들의 힘든 세포 벽 때문에, 연구원이 직면 하는 주요 도전은 세포 콘텐츠를 손상 하지 않고 효 모 세포의이 효율적인 lysis. 그대로 생물학적 거대 분자의 분리는 일반적으로 온도에 따라 중요합니다.
저온에서 추출물을 준비하면 세포내 프로테아제와 뉴클레아제가 비활성 상태로 유지되어 충분한 용액을 위한 그대로 단백질, 핵산 및 기타 거대 분자의 신뢰할 수 있는 절연이 발생합니다. 효소, 화학 적 및 물리적 용액을 통해 효모 추출물을 얻기위한 다양한 방법이 있습니다. 그러나 효소 용해는 세포벽을 소화하기 위해 정제 효소의 요구 사항으로 인해 비용이 많이 들므로 적은 수의 세포의 사용을 제한합니다.
또한 효소 반응은 세포의 소화와 조기 용액을 방지하기 위해 밀접하게 모니터링되어야합니다. 강력한 데진제를 사용하는 화학적 방법은 효과적이지만 단백질의 변성 등의 결과를 초래하며, 단백질 복합체 또는 기능성 효소의 분리에 적합하지 않다. 프랑스 프레스에서 고압하에서 리시스와 같은 물리적 방법은 4섭씨에서 추위속에서 수행될 수 있지만 모든 토착 단백질의 분해및 분해를 방지할 만큼 춥지 않습니다.
다른 인기있는 물리적 방법은 용해 버퍼에서 다시 중단 효모 세포를 분쇄하고 물방울또는 연삭 및 빠른 준비 비터 밀 또는 초음파 처리에 의한 용해로 유리 구슬과 효모의 혼합물로 냉동하는 박격포와 유봉, 믹서기 또는 커피 분쇄기의 사용입니다. 그러나 수동 연삭은 노동 집약적이며, 그 결과 단백질 수율은 블렌더, 커피 분쇄기 또는 비드 비터 밀에서 초음파 처리 또는 연삭에 의해 용해하면서 사용되는 기술에 따라 상당히 달라질 수 있으며, 이는 단백질 분해 및 저하를 초래한다. 따라서, 기능성 단백질 복합체의 정화, 생화학적 작용 제의 또는 짧은 번역 후 수정의 검출과 같은 응용분야에 대한 최소한의 분해와 함께 자국 에서 단백질로 효모 세포 용액을 얻으려면, 세포 수량에 관계없이 효율적인 라이시스를 허용하면서 열 생성을 최소화할 수 있는 확장가능한 용해 방법을 사용하는 것이 필수적이다.
여기서 우리는 동결된 세포 추출물을 생성하는 영하 196섭에서 액체 질소에 있는 세포의 용해에 대한 냉동고 밀을 사용하여 단백질이나 DNA 및 RNA와 같은 온전한 기능성 거대 분자의 회복을 허용하는 방법을 설명하며, 이는 매우 낮은 온도에서 분해 및 분해를 최소화합니다. 이 방법은 법의학 및 고대 샘플을 포함하여 모든 종에서 모든 유형의 세포 또는 조직 샘플과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응 할 수 있습니다 고고학 유적지에서 회수되거나 퍼머 프로스트에서 얼어 붙은 것으로 나타났습니다. 냉동고 공장은 스테인레스 스틸 엔드 플러그 사이에 분쇄될 샘플을 포함하는 폴리카보네이트 파일 내에서 고체 금속 막대를 앞뒤로 빠르게 이동하는 초전도 전자기 분쇄 챔버를 사용합니다.
이 물리적 셀 용해 방법은 보다 효율적인 용해를 허용하고 재현적으로 더 나은 품질의 추출물을 초래합니다. 효모 세포는 밀 당 1천만 개의 세포 농도로 성장하였다. 이러한 효모 세포는 미리 차가운 원심분리기 병을 배치하고 스핀이 완료되면 2, 400 G.에서 10 분 동안 회전하여 펠릿 세포를 방해하지 않고 상류제를 데칭하였다.
이 펠릿은 소량의 얼음 차가운 물로 재중단되었으며, 세포를 세척하기 위해 배양의 초기 부피의 약 절반정도가 재주중단되었다. 다시 중단 된 세포는 다시 2, 400 G.에서 또 다른 10 분 동안 회전했다. 이 펠릿은 다시 중단되고 얼음 차가운 리시스 버퍼 15 ML이 됩니다.
펠릿이 완전히 다시 중단되었는지 확인합니다. 다시 중단된 세포는 다음 단계를 준비할 때까지 미리 표시된 튜브의 얼음 위에 남아 있어야 합니다. 안전 안경, 손 보호 및 실험실 코트와 같은 액체 질소를 취급할 때 항상 개인 보호 장비를 착용하십시오.
손재주를 극대화하기 위해 두 쌍의 니트릴 장갑 사이에 끼워진 흰색 열 장갑을 착용하는 경우가 많습니다. 액체 질소에 노출된 후 쉽게 찢어지면서 외부 및 니트릴 장갑을 자주 교체합니다. 우리의 실험실에서, 우리는 작은 5 리터 액체 질소 용기에 액체 질소의 알리쿼트전송.
액체 질소는 드라이 아이스에 미리 냉각 된 50 ML 튜브에 부어. 50 ML 튜브가 액체 질소로 가득 차면 효모 추출물을 천천히 추가하여 1.5 밀리리터 단위로 튜브에 현명한 방식으로 떨어뜨립니다. 대형 팝콘 펠릿의 형성을 최소화하기 위해 효모 서스펜션이 원형 동작으로 추가됩니다.
대형 팝콘 펠릿의 형성을 더욱 막기 위해 대형 포셉을 사용하여 모든 펠릿이 직경 0.3~0.5cm 사이인지 확인합니다. 액체 질소는 항상 증발하기 때문에 효모 현탁액의 각 1.5 mil 알리쿼트를 추가하기 전에 액체 질소로 튜브를 다시 채웁니다. 모든 효모 현탁액이 팝콘으로 만들어지면 팝콘이있는 튜브가 2 ~ 3 분 동안 뚜껑없이 앉을 수 있어 잔류 액체 질소가 모두 증발하게합니다.
모든 액체 질소가 증발했는지 확인하려면 뚜껑을 거의 완전히 닫고 부드럽게 흔들어 주세요. 히싱 노이즈가 있는 경우 액체 질소가 아직 완전히 증발하지 않았다는 것을 나타냅니다. 뚜껑을 단단히 닫기 전에 나머지 액체 질소가 증발할 수 있도록 뚜껑을 1분 정도 열어 주세요.
뚜껑이 조기에 닫히면 튜브내 잔류 액체가 폭발을 일으킬 수 있습니다. 이 효모 팝콘은 영하 80도 C.에 거의 무기한 저장될 수 있습니다.적어도 5개의 샘플의 경우 30~35리터의 액체 질소를 사용할 수 있는지 확인합니다. 냉동고 밀을 전체 선으로 채우고 뚜껑을 닫아 냉동실 공장이 몇 분 동안 식기를 미리 식힐 수 있도록 하십시오.
다시 말하지만, 액체 질소를 다룰 때 항상 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 폴리카보네이트 연삭 바이알, 스테인리스 스틸 엔드 플러그 및 임펙터 바는 액체 질소로 미리 냉각되어야 합니다. 액체 질소가 버블링을 멈출 때까지 이러한 성분을 물에 담그십시오.
전체 연삭 과정이 완료 될 때까지 드라이 아이스에 모든 팝콘 샘플을 유지하는 것을 기억하십시오. 연삭 바이알에서 모든 액체 질소를 꺼내 서 유리병에 팝콘을 전송. 연삭 바이알에도 마그네틱 임펙터 바를 배치하는 것을 잊지 마십시오.
스테인레스 스틸 플러그를 연삭 유리병 끝에 고르게 배치하여 연삭 유리알을 밀봉하십시오. 우리는 최종 플러그가 올바르게 배치되고 연삭 유리병을 단단히 밀봉하는 것을 보장하기 위해 진동 흡수 고무 백업나무 브레드 보드에 연삭 유리병의 각 끝을 강타합니다. 엔드 플러그를 고정하여 플러그가 느슨해지지 않도록 하고 분쇄 과정에서 샘플이 냉동고 공장에서 유출되도록 하는 것이 중요합니다.
냉동실 분쇄실에 연삭 유리병을 놓고 제자리에 고정하십시오. 냉동고 밀 뚜껑을 닫고 14의 분쇄 속도로 사이클 당 2 분에서 3 사이클로 샘플을 갈아. 분쇄 주기가 완료 된 후 냉동 분말 셀 lysate와 유리병의 잠금을 해제합니다.
용해가 해동되지 않도록 하려면 개구부 도구를 사용하여 최종 플러그 중 하나를 풀기 위해 신속하고 신중하게 작업하십시오. 바이알이 열리면 임펙터 바를 제거하고 냉동 분말 추출물을 미리 차가운 플라스틱 계량 접시에 신속하게 전달합니다. 나무 빵보드에 유리병을 두드리며 가능한 한 많이 냉동 추출물을 회수합니다.
모든 분말이 유리병에서 제거되면 모든 분말 추출물을 미리 라벨이 부착된 15밀 튜브로 빠르게 전달하여 드라이 아이스에 보관합니다. 단백질 분해를 최소화하기 위해 즉시 추출물을 해동하고 사용하는 것이 가장 좋습니다만, 냉동 분말 용액은 필요한 경우 영하 80에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 얼음 양동이에 마그네틱 교반 바를 사용하여 지속적으로 순환되는 얼음 슬러리에서 분말 을 천천히 해동하십시오.
해동을 용이하게 하기 위해 튜브 바깥쪽에서 자주 발생하는 얼음을 약 5분마다 제거합니다. 일단 추출물이 단백질 분해를 방지하기 위해 1X 프로테아제 억제제 칵테일과 10 마이크로몰라 프로테모솜 억제제 MG132에서 해동하기 시작합니다. 샘플이 완전히 해동되면 1 시간 이상 걸릴 수 있으며 샘플을 섭씨 4도에서 20 분 동안 3, 220 G로 회전하십시오.
이 스핀은 lysate에서 세포 파편의 대부분을 제거합니다. 스핀이 완료되면 상체를 얼음에 미리 냉각된 폴리 카보네이트 병으로 옮기고 펠릿을 폐기합니다. 16, 000 G에서 16, 000 G에서 20분 동안 초판 및 샘플을 원심분리하여 추출물을 명확히 합니다.
스핀이 완료된 후, 원심분리기 튜브 의 하단에 있는 조각이나 펠렛 이물질을 포함하는 흐린 층을 방해하지 않고 액체 컬럼 의 중간에서 명확한 상체만 조심스럽게 복구하십시오. 맑은 리세이트를 신선한 사전 냉장 15 밀 튜브로 옮춥니다. 나머지 흐린 액체는 최근 5 분 동안 동일한 속도로 리퓨징되어 일부 도매 용액을 회수 할 수 있습니다.
추출물은 이제 단백질 복합체의 정제 및 면역 강수량과 같은 실험에 사용할 준비가 되었습니다. 우리는 효모 세포 리시스의 두 가지 다른 방법, 즉 유리 비드 밀링 4 섭씨에서 및 마이너스 196 섭씨에서 자동화 된 냉동 분쇄 방법을 비교하여 두 가지 방법으로 제조 된 상대적 회수 된 단백질과 세포 추출물을 평가했습니다. 이 연구에서 우리는 함께 HIS-MYC 태그 유비퀴틴을 표현하는 높은 복사 플라스미드를 들고 신진 효모 변형을 사용하기로 결정했습니다.
그래서 우리는 탈론 코발트 HIS 태그 선호도 구슬을 사용하여 친화 정화에 따라 도매 추출물에서 태그된 폴리비비퀴티네이트 단백질의 회복의 선호도를 평가할 수 있으며, 그 다음으로 모노클론 HIS 태그 항체로 서양 블로팅을 할 수 있습니다. 일반적으로 유비퀴틴 프로테솜 기계에 의한 급속한 분해로 인해 매우 수명이 짧은 폴리비비쿼터트 단백질은 다른 방법으로 제조된 도매 추출물의 품질을 비교할 수 있는 아주 좋은 방법을 제공합니다. 우리는 Ponceau 스테인드 멤브레인 막의 오른쪽 절반에 의해 볼 수 있듯이, 우리는 도매 추출물 차선 을 통해 더 집중적인 Ponceau 염색에 의해 판단으로 냉동고 밀 프로토콜에 의해 제조 된 도매 추출물에서 더 높은 총 단백질 수율을 회복.
이것은 냉동고 공장 전체 추출물 차선의 하부 및 상부에서 특히 분명합니다. 또한, HIS 태그 서양 얼룩의 오른쪽 절반에 의해 표시된 바와 같이, 우리는 동결 연삭에 의해 제조 된 도매 추출물에서 탈론 구슬을 사용하여 아래로 당겨 다음 HIS-MYC 태그 유비쿼터트 단백질의 더 나은 회복을 관찰했다. 우리는 극저온 냉동고 공장이 특히 다운스트림 적용을 위해 기능성 거대 분자가 필요한 경우 세포 추출물의 제조를 위한 다른 방법보다 우수하다는 결론을 내립니다.
