우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

96 - 웰 플레이트의 1. 준비 <ol><li> 9 μL 하나의 세포 용해 용액에 하나의 세포 DNase1 1 μl를 섞는다. </li><li> 96 - 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕를 혼합 용액을 넣어. </li></ol> FACS 정화 2. 분리 및 인간 배아 줄기 세포 <ol><li> 인간 ES 매체와 중화 된 37 ° C에서 20 분간 1 ㎖ Accutase와 60mm 접시,에서 OCT4 :: EGFP ES 세포주를 분리합니다. </li><li> FACS는 버퍼 1 ML에 세포 인구를 준비하고 1 X 10 6 세포 / ml로 셀을 조정합니다. </li><li> 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포 샘플을 전달합니다. </li><li> 셀 정렬하기 전에 얼음에 튜브를 저장합니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 FACS 정제 된 단일 셀의 3. 용해 <ol><li> 숙련 된 운전자와 셀 분류기에 EGFP 양성 세포의 샘플을 정렬합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트에 하나의 세포 Lysis/DNase1 솔루션으로 단일 셀을 넣습니다. 필요한 경우, 구샘플 6 - 웰 플레이트 한 달 미만 -80 ° C 냉동고에 저장 될 수 있습니다. </li><li> 세포 용해 실온에서 시료에게 5 분을 품어. </li><li> 용해 반응을 중지하려면 중지 솔루션 1 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 2 분을 품어. </li></ol> 4. 역전사 <ol><li> 20 μM SMA-T15, SMA-A의 각각 0.5 ㎕의 분취 량을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 물론 각 4 μL 배 버퍼, 2 μL DTT, 1 μL 역전사, 1 μL의의 dNTP를 추가합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람에 역전사를 수행합니다. <ol><li> 90 분 × 42 ° C에서 열 프로그램을 설정하고 85 ° C × 5 분에 역전사을 비활성화. </li></ol></li></ol> 5. 증폭 <ol><li> 각 역 전사 샘플 ExoSAP-IT 시약의 4 μl를 추가합니다. <ol><li> ExoSAP-IT 시약을 비활성화하는 15 분 15 분 80 ° C, 37 ° C에서 샘플을 품어. </li></ol></li><li> PCR 반응 혼합물을 제조 wi 번째 SMA-P2 (2 NM) </li><li> 각 역 전사 샘플 PCR 반응 혼합물의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 변성의 20주기 (30 초 94 ° C), 어닐링 (30 초 57 ° C) 및 확장 (68 ° C 10 분)로 구성된 증폭을 수행합니다. </li></ol> 6. QRT-PCR 성능 <ol><li> 물론 각 2X SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스, 1 μL 증폭 된 cDNA, 2 nm의 프라이머, 7 μL의 물 10 μl를 추가합니다. <ol><li> 3 초 동안 95 ° C 다음에 프로그램을 설정, 30 초 × 40주기 동안 60 ° C에서. </li></ol></li><li> 기술적 인 오류에 대한 중복 수행합니다. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells.">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li><li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

단일 세포 유전자 프로파일은 단일 세포의 기능이나 전체 인구를 예측할 수있는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 기술적 인 제한으로 전체 유전자 프로파일 분석은 인구의 평균으로 제한하고있다. 유전자 발현 패턴 및 개별 세포 모집단 사이 수준의 변화는 잘못된 해석을 일으키는 것으로 제안되어왔다. 이러한 다양한 셀룰러 양태는 인간 배아 줄기 세포에서 발견 될 수 있고, 그들의 이질성 능성 ...

가장 높은 진핵 생물의 인구가 풀링 인구의 분석에 따라서 이기종 있으며, 그것은 자신의 휴대 전화 기능을 해석하는 것이 어렵습니다. 인구 내의 개별 세포가 미묘하게 다를 수 있습니다, 그리고 이러한 차이는 전체 인구의 1, 2의 속성과 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 섬세 독특한 방법으로 3, 4의 혈통 사양을 능성의 서로 다른 수준의 다양한 잠재력을 일으키는 이기종 것으로 알려져있다. 예를 들어, 다른 세포 표면 항원이 미분화 다 능성 줄기 세포를 분류하기 위해 사용될 수있다, (5) 및 오스틴 스미스 그룹은 그들의 형태, 감별 성향 및 통로 6 시그널링 종속성에 기초하여, 마우스 배아 줄기 세포의 다 능성의 상이한 레벨을 제안 하였다. 이러한 현상은 인간의 배아에 가설 된NIC 줄기 세포 12. 전체적인 연구는 다른 줄기 세포가 아닌 개별 단일 줄기 세포 사이에 수행 된 반면, 잠재적으로 모든 체세포 계통쪽으로 분화 능력에 영향을 단일 세포 수준에서 다 능성의 상이한 레벨을 분석하는 것은 매우 흥미로운 일 수 있었다. 세포 및 분자 이질성은 &#39;단일 세포의 사체&#39;라고하는 전사 프로파일에 의해 결정 및 유전자 발현 수준 8-10 정량화에 대한 새로운 접근 방식을 강조 할 수있다. 각각의 세포에서 유전자 발현 수준의 분석을 위해, 우리는 하나의 셀 정량적 RT-PCR의 간단하지만 강력한 프로토콜을 개발했다. 우리는 최소한의 기술적 변화와 차이의 결과로, 각각의 단일 세포 용 해물의 절반뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포의 희석 한 총 RNA를 비교하여 우리의 프로토콜의 효과와 가능성을 확인했다. 또한, 우리는 동질적인 (P)를 분리하는 유전자 기자 라인을 사용유전자 타겟팅 시스템을 이용하여 인간 배아 줄기 세포의 opulation. OCT4 궤적 (OCT4-2A-EGFP-PGK - 푸로가 구성) 및 TALEN 플라스미드의 한 쌍을 대상으로 대한 기증자 벡터 (11)를 사용 하였다. 기증자 벡터와 TALEN 플라스미드 한 쌍의 우리의 nucleofection 및 클론 선택 프로토콜과 인간 배아 줄기 세포는 우리의 일상적인 프로토콜 12을 기준으로 수행 된 유지 보수를 이용하여 인간 배아 줄기 세포 (H9, WA09)에 소개되었다. 우리는이 유전자 기자 라인 OCT4에 OCT4의 표현 EGFP을 표현 :: EGFP 인간 배아 줄기 세포를 확인했다. 우리의 결과는 (OCT4으로 분류 :: EGFP 강하게 양성 세포) 각각의 인간 배아 줄기 세포는 OCT4 표현의 높은 수준,하지만, NANOG 식의 다른 수준을 유지 것을 보여줍니다. 따라서, 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 다 능성 줄기 세포의 인구 이질성을 연구하는 것이 유용 할 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="807">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">96 wll PCR Plate</td>
			<td style="width:123px;">USA scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-8900</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Ambion Cell Lysis Kit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SMARTScribe Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:123px;">Clonetech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">639536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ExoSAP-IT</td>
			<td style="width:123px;">USB</td>
			<td align="right" style="width:119px;">78200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mM dNTP Mix, PCR Grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SYBR Universal 2X Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Kapa biosystem</td>
			<td style="width:119px;">KR0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>S-1100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr

줄기 세포 인구의 이질성은 다른 계통쪽으로 분화 성향으로, 줄기 세포 생물학에 대한 자세한 이해를 방해한다. 단일 세포 사체 분석은 개인차를 해부하기위한 새로운 접근 방식이 될 수 있습니다. 우리는 하나의 셀 QRT-PCR 방법을 개발하고,이 방법은 여러 유전자 발현 프로파일에서 잘 작동하는지 확인했다. 단일 세포 수준에서 OCT4으로 분류되어 각각의 인간 배아 줄기 세포, :: EGFP 양성 세포는 OCT4 높은 표현하지만, NANOG 표현의 다른 수준이 있습니다. 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 인구의 이질성을 심문하는 것이 유용 할 것이다.

효율적이고 강력한 단일 세포의 RNA 증폭 인간 배아 줄기 세포 사이의 전사 변화를 최소화하기 위해, 우리는 OCT4을 사용 :: FACS 정화용 EGFP hESC의 클론. 96 - 웰 플레이트에 OCT4 :: EGFP 양성 세포를 선별 한 후, 각 세포는 용해 버퍼에 용해하고 SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) 프라이머를 사용하고 SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG로 고정 된 전체 길이의 cDNA에 ?...

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Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

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Biology

11.4K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine.  단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다. 