This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.

주의 : 사용하기 전에 각종 시약의 물질 안전 보건 자료 (MSDS에) 참조하십시오. 시료 전처리 과정에 사용되는 화학 물질의 일부 ​​및 / 또는 생식 독성, 발암 성 독성, 돌연변이이다. 샘플을 처리하는 동안 흄 후드 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발) 작업을 사용합니다. 을 Ultramicrotome 시료를 단면 예리한 도구의 사용을 포함하고, 이러한 도구주의 사용은 필수이다. 후술하는 단계에서, 저자는 시료 세포 배양 샘플이라고 가정한다. 프로토콜은 샘플 유형 특히 원심 분리 단계에 따라 수정 될 필요가있다. 버퍼와 혼합물의 제조 1. <ol><li> 인산 완충 용액 (PBS) 용액을 준비한다 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 및 1.76 mM의 KH 2 PO 4). </li><li> 30 %, 50 %, 70 % 등을 함유하는 용액을 준비샘플 탈수 PBS에서 한올. 점차적으로 에탄올 농도를 증가의 샘플을 배양하여 샘플 탈수를 수행합니다. </li><li> (숙신산 무수물 (9 ㎖), 메틸 -5- 노르 보르 넨 -2,3- 디카 르 복실 산 (11 mL)에 2,4,6- 트리스 도데 세닐 비스페놀 A- (에피 클로로 히 드린) (20 ㎖)을 혼합하여 에폭시 수지를 준비 디메틸 아미노 메틸) 페놀 (0.7 ㎖); 다른 혼합 비율은 수지의 원하는 경도에 따라 사용될 수있다. </li><li> 샘플 매립 에탄올 30 %, 50 %, 70 %의 에폭시 수지를 함유하는 용액을 준비한다. 서서히 수지 농도의 증가와 함께 샘플을 배양하여 수지 매립을 수행한다. 주 : 준비된 솔루션의 볼륨이 연구되고있다 샘플의 유형에 따라 달라집니다. 추가 용액을 세포 배양에 비해 조직 필요하다. </li></ol> 샘플 2. 고정 및 착색 <ol><li> g X 5000에서 5 분 동안 세포 배양을 원심 분리기. 동일한 조건을 사용하여 다음 회 원심을 모두 수행한다.</li><li> 뜨는을 취소하고 4 % 파라 포름 알데히드와 2 % 글루 타르 알데히드와 PBS (1 ㎖)에 그것을 재현 탁하여 세포 펠렛을 수정합니다. 30 분 (도 1a)을 실온에서이를 부화. 또한, 야간 또는 주말에 4 ° C에서 세포를 고정합니다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 완전히 정착 제를 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척 하였다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 PBS (1 mL) 중에 1 % OSO 4 샘플 포스트 픽스. </li><li> 원심 분리 후, 상층 액을 제거하고 완전히 OSO 4 제거하기 위해 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 반복한다. 석유 및 폐기에 OSO 4를 비활성화합니다. </li><li> 조영제로서 PBS (1 mL) 중 2 % 우라 닐 아세테이트를 첨가하고, 실온 (도 1b)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 미 결합 우라 닐 AC를 제거하는 PBS (1 mL)로 펠렛을 3 회 세척etate; 우라 닐 아세테이트는 방사성 원소를 포함하고 방사성 폐기물 전용 bin에의 배치해야합니다. 주의 : 샘플의 크기에 따라 배양 시간을 변경할 수있다. 예를 들어, 고정 및 조직 샘플과 같은 두꺼운 샘플 염색의 경우, 더 이상 배양 시간을 필요로한다. 긴 배양 시간은 탈수 및 매립 단계를 더 좋을 수있다. 우라 닐 아세트산 가돌리늄 염을 포함하는 &quot;우라 닐리스&quot;솔루션으로 대체 될 수있다. </li></ol> 3. 샘플 탈수 <ol><li> 원심 분리 후 상층 액을 버리고 30 % 에탄올로 PBS에 39 ° C (1 ㎖) (도 1C)에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 점차 상승 에탄올 농도 (50 %, 70 %, 100 %까지) 용액을 사용하여 반복 스텝 3.1. 이러한 탈수 단계 동안, 샘플 보존을 위해 4 ℃에서 시료를 유지한다. </li><li> 원심 분리 후, supernat 폐기개미와 순수 에탄올 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li></ol> 4. 수지 퍼가기 <ol><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 RT (도 1D)에서 30 분 동안 30 %의 에폭시 수지 (1 mL)을 에탄올에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 점차 상승 에폭시 수지 농도의 용액을 사용하여 반복 스텝 4.1 (50 %, 70 %, 100 %까지). </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 버리고 순수 에폭시 수지 (1 mL) 중 펠렛을 재현 탁; RT에서 하룻밤을 품어. 수지의 중합을 실행할 수 DMP-30 경화의 존재; 이 경우, 에폭시 수지의 두 배치, 하나와 DMP-30없이 하나를 준비합니다. </li><li> 원심 분리 후, 순수 에폭시 수지의 200 μL 플라스틱 캡슐 (경화제를 포함)에 펠렛을 재현 탁; 샘플은 플라스틱 캡슐의 바닥에 있어야합니다. </li></ol> 5. 수지 중합 <ol><li> 나는48 시간 동안 60 ℃로 설정된 항온 시료를 함유하는 플라스틱 캡슐 ncubate; 수지의 다른 종류의 서로 다른 설정으로 중합 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 캡슐을 제거하고 수지를 중합 있는지 확인; 하드 표면에 누를 경우 수지 열심히해야한다. </li><li> 샘플을 함유하는 중합 된 수지 위에 (경화제 포함) 순수 에폭시 수지를 추가; 수지의이 한층 더 쉽게 샘플을 잘라 만들 것입니다. 48 시간 동안 60 ℃에서 인큐베이션 캡슐. </li></ol> 6. 샘플 단면 <ol><li> 샘플 상단을 향해되도록 시편 홀더의 샘플 거꾸로 장착하고을 Ultramicrotome의 트리밍 블록에 고정합니다. 단단히을 Ultramicrotome에 트리밍 블록을 확보하기 위해 레버를 잠급니다. </li><li> 면도날 또는 유사한 날카로운 절단 공구를 사용하여 중합 된 수지를 분리하는 플라스틱 캡슐을 잘라. 샘플이 포함되도록 수지 컷피라미드의 약 모양 수지 에디션. 전체 플라스틱 캡슐을 제거 할 필요는 없다; 단지 중합 샘플을 덮고있는 부분을 제거합니다. </li><li> 캡슐 및 트리밍 블록의 오프 시편 홀더를 타고을 Ultramicrotome의 이동 팔에 설치합니다. </li><li> 칼 블록에 트리밍 나이프를 설치하고 정확하게 피라미드의 얼굴을 잘라. 쌍안경의 사용은 피라미드에 대한 완벽한 모양을 제공하는 것이 좋습니다; 피라미드 더 나은, 더 나은 부분이 될 것입니다. </li><li> 트리밍 칼을 벗고 두꺼운 0.5 μm의있는 부분을 절단하는 데 사용할 수있는 조직학 나이프로 교체합니다. </li><li> 물의 정확한 양 조직학 칼 큐벳을 충전 한 후, 시료의 표면에 칼의 칼날을 가지고 상기 칼 피라미드 수직 슬라이스되도록 캡슐 피치 각을 조정 망원경을 사용한다. </li><li> 목적에 따른 절삭 속도를 조정섹션 두께는 균일 한 부분을 복구 할 수 있습니다. </li><li> 물 위에 섹션 플로트를하자 루프와 물고기. </li><li> 여과지 위에 배치 된 전자 현미경 구리 그리드 향해 루프를 이동한다. 주 : 그리드는 친수성을 증가시키기 위해 이전에 처리 된 것이다. 이것은 격자 코팅 펜으로 수행 될 수있다. </li><li> 때문에 여과지로 물 흡수 섹션 그리드에 충실 할 수 있습니다. 전자 현미경에 삽입하기 전에 몇 분 동안은 건조 보자. </li></ol> 관통 초점 기울기 시리즈의 7 디자인 <ol><li> 일정한 초점 간격으로 관통 초점 이미지를 수집합니다. 참고 : 관통 초점 틸트 시리즈는 기울기 시리즈의 각각의 경사 각도에서 수집 관통 초점 이미지 세트로 구성되어 있습니다. 전체 포커스 진폭은 전체 샘플 두께를 커버하기에 충분해야한다. </li><li> 초점 간격의 값을 결정한다. 간격은 D 같으면epth-의 필드, 초점 전체 샘플을 수집; 이 설정은 가능한 가장 높은 샘플링을 나타냅니다. 간격이 심도보다 큰 경우, 샘플의 일부분이 샘플의 일부가 초점이 수집되지 않을 것임을 의미하는 포커스에서 취득되지 않는다. </li><li> 피사계 심도 전자의 파장에서 전자 빔 및 전자 빔의 수렴 반각의 계산. 전자의 파장 직접 가속 전압에 연결되는 반면, 전자 현미경 제조자의 수렴 반각을 사용하거나 공지의 시편 (16)의 회절 패턴으로부터 실험적으로 결정한다. 전자는 파장 λ에서 가속 때문에 전자 현미경에서 α의 수렴 반각으로 샘플 충돌, 피사계 심도 (DOF)를 결정하기 위해 다음 식을 사용 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> 디자인전체 초점 진폭이 최대 명백한 두께의 샘플을 충당 할 수 있도록 초점 시리즈 (즉, 가장 높은 경사에서). 참고 : 초점 크기보다 큰 2.19 μm의를해야합니다 그래서 0.75 μm의 두께 샘플, 70 ° 경사에서 2.19 μm의 겉보기 두께를해야합니다. 상기 결정된 포커스 간격은 50 나노 미터와 동일한 경우,이 시료를 들어, 그것은 최대 겉보기 두께 샘플을 커버 (44)와 이미지 (2.19 μm의 / 50 나노 미터)를 필요로한다. 전체 포커스 진폭은 초점 단계의 수를 곱한 포커스 구간의 값과 같다. 최대 기울기 (θ)에서, 샘플 겉보기 두께는 다음과 같이 정의된다 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. 샘플 영상 참고 :이 STEM 모드에서 전자 현미경을 설정하는 방법을 설명하기 위해이 프로토콜의 범위를 벗어납니다; 이 정보의 대부분은 찾을 수 있습니다 내가n은 레퍼런스 매뉴얼은 전자 현미경 제조업체에서 제공. 그러나, 다음 참고 : I)의 스폿 사이즈는 원하는 배율에 따라 선택되어야한다; ⅱ) Ronchigram은 잘 정렬되어야합니다; 및 ⅲ) BF 모드에서 카메라 길이 검출기의 양호한 조명을 유지하면서 unscattered 전자를 선택하도록 조정되어야한다. 전자 현미경으로 구리 그리드 상에 퇴적 수지 부분 수축을 방지하는 화상 취득 전에 점등한다. 수지의 수축 및 충전 효과는 이미지 수집시 혼동 될 수 있습니다. 충전 효과가 발생 될 때 대물 렌즈의 구경의 사용은 샘플의 안정성을 향상시킬 수있다. 그러나 STEM 셋업의 특정한 경우에, 대물 조리개 HAADF 촬상 모드와 호환되지 않으며, 매우 작은 개구가 대물 BF 촬상 모드와 호환되지 않는다. <ol><li> 낮은 배율 (STEM에 20,000X 약)를 사용하여 샘플을 통해 검색하고 관심 영역을 찾습니다. </li><li> t를 조정샘플을 회전시키면서 관심 영역이 표류하지 않도록 그 높이 (Z 축) eucentric. </li><li> 관심의 대상이 전체 틸트 범위에서 볼 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 때문에 관통 초점 경사 계 중에 획득 된 이미지의 상당한 수에 자동 수집 소프트웨어를 사용한다. 어느 상용 솔루션을 사용하거나 원하는 경우 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어를 설계합니다. 소프트웨어 프로그램은 다음 세 단계를 수행 할 수 있는지 확인합니다 : <ol><li> 추적 및 표준 틸트 시리즈 수집 방식에서와 같이 초점을 맞추고있다. </li><li> 관통 초점 이미지가 샘플의 Z-위치와 중복 있는지 확인합니다. </li><li> 자동으로 각 경사각 관통 초점 일련의 이미지를 획득. </li></ol></li><li> 소프트웨어 프로그램을 관통 초점 경사 계의 주 변수를 제공 (즉, 초점 간격 초점 단계, 최소 경사각의 최대 경사 각도, 경사 공정과, 주사 속도). </li><li> 스타트소프트웨어 프로그램이 완료 될 때까지 화상 수집 처리 및 대기. </li></ol> 9. 이미지 처리 주 :이 프로토콜에서, 관통 초점 경사 계 처리 ImageJ에 플러그 (17)를 사용하여 수행된다. 보충 자료 1 정렬 단계 (Turboreg)과 세 개의 초점 값으로 설계된 관통 초점 틸트 - 시리즈 - 포커스 정보 (필드의 확장 깊이) 병합에 대한 ImageJ에 매크로를 보여줍니다. <ol><li> 동일한 경사각 (즉, 관통 초점 이미지)에서 수집 된 이미지를 맞 춥니 다. 이미지는 동일 합초 정보를 가지고 있지 않기 때문에, 이들은 정렬 동일한 기능 항구하지 않는다; 이웃 이미지를 두 가지로 두 가지를 정렬하여 정렬을 수행 (즉, 먼저 가장 가까운 초점 값으로 피라미드 계층 구조, 다음) Turboreg 18 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. </li><li> 일관 각 경사각 관통 초점 이미지의 정렬을 확인.육안 검사를 개선하기 위해 정렬 관통 초점 이미지를 스택. 참고 : 스택을 통해 탐색하는 동안 만 영역에 초점이 이동해야합니다. 다음 단계는 다른 이미지의 초점이 정보의 복구 구성 때문에 정확한 정렬은 가장 중요하다. </li><li> 필드 (19), ImageJ에 플러그인의 확장 깊이를 사용하여 초점에있는 정보를 병합; 이것은 결국 이미지의 스택에서 하나의 이미지를 생성합니다. 몇몇 설정이 심도를 복구하는 동안 사용되지만, 화상 정보를 보존하는 최고 설정을 사용할 수있다. 주 : 틸트 계 이제 경사각 당 하나의 화상으로 구성되고, 합초 정보를 포함하는 각 이미지는 관통 초점 화상으로부터 회수. </li><li> 데이터를 처리합니다. 참고 : 데이터가 이제 표준 기울기 시리즈로 감소되어 있기 때문에 정렬 및 재건을위한 표준 도구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 TomoJ 우리를이다ED 데이터 정렬 및 데이터 재구성 (20), (21). TomoJ를 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 해당 출판물 (22)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 기울기 시리즈의 미세 정렬을 수행합니다. 참고 : 좋은 전략은 정확하게 이미지 사이의 변화를 추적하는 기준 마커로 골드 비즈를 사용하는 것입니다. 골드 비드 샘플에 첨가 할 수없는 경우에 로컬 최소치가 사용될 수있다. </li><li> 정렬 된 데이터의 3 차원 재구성을 수행한다; 여러 가지 알고리즘은 실제 공간이나 푸리에 공간, 장점과 한계 각각의 복원을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 틸트 시리즈의 최종 배향 불량 인 경우, 초기 단계를 최적화하여 약간 개선 할. 최종 3 차원 복원이 흐리거나 변형 나타나는 경우 정렬 단계를 반복; 실제로 수집 초점 평면의 큰 수, 더 나은 콘트라스트 및 3D 재구성 세부. 참고 : 괜찮다veral 소프트웨어 프로그램 관통 초점 경사 계를 처리하기 위해 사용될 수있다. 그러나,이 프로토콜에 사용되는 도구가 선택되었다 때문에, 우리의 경험, 그들은 최고의 수행. Turboreg 18 초점의 구배가 존재하는 경우 이미지를 정렬의 관점에서 더 나은 수행. 자세한 내용은 전용 웹 사이트 (23)에서 찾을 수 있습니다. 다른 도구가 표시 픽셀 수정 결과 반면 필드 플러그인 (19)의 확장 깊이, 서로 다른 이미지에서의 초점 정보를 복구 측면에서 매우 잘 수행. 자세한 내용은, 특히 관련 스크립트 작성이 전용 웹 사이트 (24)에서 찾을 수 있습니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy.">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li><li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ettention+software+package.">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li><li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography.">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li><li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology.">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li><li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles.">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li><li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy.">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041 (2016).</li></ol>

We have no conflict of interest to disclose.

이 글에서, 우리는 관통 초점 단층 촬영 STEM을 사용하여 두께의 생물학적 시료에서 3D 분석을 수행하기위한 단계별 가이드와 함께 기존의 샘플 준비 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시료의 수지 매립은 수십 26에 사용되었으며, 시료의 종류에 맞게 다른 프로토콜은 문헌 (27)을 통해 찾을 수있다. 대조적으로, STEM에 영상 두꺼운 표본은 새로운 사업을 통해 초점 ?...

1970 년대 초반 이후 단층 널리 생물학적 시료 1, 2, 3의 구조적 특성에 사용 된 투과형 전자 현미경 (TEM)에 접근한다. 투과형 전자 단층의 매력이 전지의 구조 및 고분자 복합체 단백질의 구조 내 소기관의 미세 구조에서, 나노 스케일에서 생체 구조의 광범위한 연구하는 데 사용할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 투과형 전자 단층은 매우 두꺼운 샘플 (이상이 0.5㎛)을 연구하기 위해 이용 될 수 없었다. 실제로 두께 시험편 낮은 신호대 잡음비 (SNR)의 이미지를 생성하는 너무 많은 산란 전자를 생성한다. 또한, 단층의 경사각 증대 시료의 겉보기 두께, 기울어 진 시험편의 이미지의 컬렉션을 포함한다. 심지어 비탄성 산란을 필터링 할 수 있습니다하지만에너지 필터를 사용하여, 높은 SNR 이미지에 필요한 전자의 임계량 거의 TEM에 도달한다. 따라서, 생물학적 시료의 두께는 단지 4 절편하여 연구되어왔다. 들이 절단 될 때 약간 저하 될 수도 있고, 다른 복잡성을 이해하기 위해 그 전체 연구 할 필요 일부 샘플은 분리 될 수 없다. 다른 방법은 스캔 모드 5, 6, 7, 8의 TEM을 사용하는 것이다. 투과 전자 현미경 (STEM)를 스캐닝, 전자의 광로가 종래의 TEM에서 다르다. 탄성 산란 그는 어두운 필드 (DF) 탐지기와 광축으로부터 소정의 각도에서 수집 될 수있는 반면 산란없이 샘플을 통과하는 전자는 밝은 필드 (BF) 검출기 (9)의 광축 상에 수집 될 수있다.STEM의 또 다른 장점은 집속 전자 빔 이미지의 픽셀 별 수집을 가능하게 시료의 표면에 주사되어있다. 시료 (10)를 통과하면서 전자빔이 넓어진 경우에도 특정 컬렉션 기법은 종래의 TEM 비탄 성적으로 산란 전자보다 덜 민감하다. 또한, TEM에 따라서 발생할 수있는 색수차 회피 STEM에는 렌즈 후의 시험편 없다. BF 검출기는 주로 unscattered 전자를 검출하도록 카메라 길이를 조정할 수있다. 두꺼운 샘플을 연구하기 위해 DF 검출기를 사용 때문에 부정확 한 이미지를 생성 다중 산란,하지 않는 것이 좋습니다. 대신, BF 검출기 (11)를 사용할 수있다. STEM 높은 SNR 이미지를 생성 할 수 있지만, 두께로부터 회수 될 수 깊이있는 정보의 양이 감소하기 때문에 TEM에 비하여 상대적으로 높은 광 수렴 비교적 낮은 심도를 갖고표본. 초점이 정보가 몇 나노 미터의 초점면에서 유래되도록 수렴 각도가 30 MRAD만큼 높을 수있는 수차 보정 STEM 현미경의 경우, 피사계 심도는 충분히 낮을 수있다 . 병렬 모드에 전자선을 설정하면 심도 전자빔의 해상도 (12)의 손해를 향상시킨다. 그러나,이 설정이 항상 가능한 것은 아니다. 이 수속 전자빔을 사용하는 것이 필요할 때마다, 하나의 두꺼운 샘플을 연구 할 때 심도 전자빔의 향상 기술을 사용한다. 최근 연구의 초점 정보 (13), (14)의 최대 양을 복구하는 시료에 걸쳐 다양한 초점 평면에서 다수의 이미지의 취득을보고 하였다. 두 연구에서 상이한 초점 평면의 정보를 처리하는 다양한 방법을 설명한다. Hovden 등은.다양한 초점 평면에서 수집 된 이미지는 푸리에 공간에서 결합하고 최종 재구성 13 변형 차원 역 푸리에로부터 직접 얻었다. 이에는 DAHMEN 외. 실 공간의 다양한 초점 평면 (14)로부터의 3 차원 볼륨을 재구성 수렴 빔 복원 엔진을 개발했다. 본 연구실은 두꺼운 생물학적 시료를 이미징하는 방법을 개발 하였다. 우리의 전략은 우리가 다양한 초점 평면에서 초점이 정보를 병합하고, 평행 광선 조사 장치 (15)를 이용하여 실 공간에서의 최종 3 차원 볼륨을 복원한다는 점에서 상기 한 두 방법과 다르다. 우리의 목표는 쉽게 전자 현미경 실험실에서 수행 될 수있는 방법을 개발 하였다. 이를 위해 종래의 단층 실험의 시간 프레임에 필적 ​​제한된 시간에 촛점 이미지를 수집 할 목적. 또한, 제안 된 방법 C정렬 및 재구성 소프트웨어의 종류와 사용하기 위해 적응 될 울드. 2015 15 우리 출판물의 맥락에서, 우리는 시각화와 피사계 심도의 회복을 특성화하고 싶었다, 그래서 우리는 25 MRAD의 큰 수렴 반 각도를 사용했다. 여기서는 2015 년 15 실험실에서 개발 된 방법에 따라 STEM에 관통 초점 촬상 행하는 단계별 프로토콜을 제공하고, 우리는 2015에서의 데이터 처리 방법을 제시 하였다. 이 방법은, 두께 (750 ㎚) 생물학적 샘플에 걸쳐 여러 초점 평면에서 초점 정보를 복구하고 고품질의 3D 재구성을 가능하게한다. 어디 관련, 다른 그룹에서 사용하는 방법에 비해이 방법의 차이도 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 &#176;C. 
			Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin Capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triming and Histo knives</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>Diatome diamond knives</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy copper grid</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>G200-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Coating Pen</td>
			<td>LFG Distribution</td>
			<td>70624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Holder</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EM-21311 HTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2200FS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and observation of thick biological samples by scanning transmission electron tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

우리의 연구에서, 전자는 전계 방출 총 투과형 전자 현미경 200 kV의 가속되었다. 이미지는 20 μs의 지속 시간을 사용하여 줄기 BF 모드로 수집되었다. 관통 초점 틸트 시리즈의 디자인에 관해서는, 우리는 750 nm 두께의 생물학적 샘플도 전자빔의 피사계 심도가 있었지만 단지의 미세 구조 연구에 대한 만족스러운 결과를 준 내지 150 nm의 초점 간격을 발견 3 nm의 때문에 우리는...

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K 조회수.  Campus Universitaire d'Orsay. This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

비디오: Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

연구

생물학

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...