이 프로토콜은 강성, 단백질 조성 및 세포 형태학과 같은 세포 외 매트릭스의 특성이 비용 효율적이고 촉진적인 방식으로 정확하게 제어될 수 있는 세포 배양 플랫폼을 제공한다. 이 방법은 비용 효율적이며 특별한 교육이나 시설이 필요하지 않습니다. 또한 면역형광 염색 및 서부 블롯과 같은 다중 세포 정량화 방법과 도 호환됩니다.
이 기술은 슈완 세포 생물학의 기계적 이해를 제공합니다. 신경계 재생을 위한 생체 재료 설계에 대한 추가 통찰력으로, 그것은 모든 앵커리지 종속 세포에 적용 될 수있다. 이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 마이크로컨택 인쇄입니다.
프로토콜의 시작 전에, 식물성을 사용하여 기판에 마이크로접촉 인쇄를 하여 단백질에 태그를 지정하여 패턴에 대한 최종 인쇄를 시각적으로 검증합니다. 먼저 PDMS 베이스 엘라스토머와 경화 제의를 파이펫 팁과 혼합하여 거품이 혼합물 내에서 균질하게 분산될 때까지 한다. 그런 다음 진공 건조로 기포를 제거합니다.
탈지 된 PDMS 혼합물을 사각형 또는 원형 커버 슬립에 넣고 30 초 동안 2, 500 rpm의 스핀 코터에 커버 슬립을 회전시십시오. 커버슬립을 섭씨 60도, 1~2시간 또는 밤새 실온에서 오븐에 배양합니다. 마이크로 패턴기판을 제조하려면 패턴 실리콘 웨이퍼를 15mm 높이에 15mm 높이의 페트리 접시에 넣고 드가스 PDMS를 웨이퍼에 붓습니다.
하룻밤 사이에 60도의 오븐에서 PDMS를 고형화했습니다. PDMS를 실온으로 냉각시키십시오. 그런 다음 외과 메스를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 손상시키지 않도록주의하는 올바른 패턴을 포함하는 30 x 30 밀리미터 제곱의 우표를 잘라냅니다.
PDMS 스탬프와 튜닝 가능한 커버 슬립을 70%에 단올로 30분 간 담그어 소독합니다. 마이크로패턴의 효능을 확인하기 위해, 여과된 공기 스트림과 파이펫 15 마이크로그램당 밀리리터 BSA 용액을 사용하여 PDMS 우표의 표면을 건조하여 스탬프의 전체 패턴 측면을 덮습니다. BSA 용액을 실온에서 1시간 동안 배양하여 단백질 흡착을 허용한 다음, 우표를 공기건조하여 BSA 용액을 제거합니다.
여과된 공기 스트림을 사용하여 튜닝 가능한 커버 슬립의 표면을 건조시다. 스탬프의 패턴 측면을 튜닝 가능한 커버슬립과 상식접촉을 하여 커버슬립 표면의 BSA 흡착을 허용하고 5분 동안 커버슬립에 스탬프를 부드럽게 누릅니다. FITC 필터를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 마이크로 패턴을 검사합니다.
형광 패턴이 아닌 세포 접착제 부위를 인쇄하려면 BSA 단백질용 라미닌을 대체합니다. 커버 슬립에서 우표를 제거하고 커버 전표를 멸균 된 6 웰 플레이트로 옮킨다. 커버 슬립의 표면을 덮고 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 배양하기 위해 각 우물에 0.2 %의 플루론 F-127 용액 2 밀리리터를 추가하십시오.
F-127 용액을 흡기하고 PBS로 5회 커버를 세척한 다음, 세포 배양 배지와 함께 한 번, 슈완 세포를 1000세포 제곱의 파종 밀도로 시드한다. 세포 파종 후 45분 후, 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 커버 슬립을 두 번 세척하여 여러 세포가 동일한 패턴을 준수하지 않도록 합니다. 정량화 하기 전에 48 시간 동안 원하는 세포 배양 환경에서 세포를 유지 합니다.
정렬된 세포를 검사하기 위한 선 패턴 세포 배양 기판을 만들려면 원고 방향에 따라 우표를 만들고 원하는 차원으로 자른다. 앞서 설명한 대로 튜닝 가능한 PDMS 표면으로 코팅된 페트리 접시 2개를 준비하고 마이크로컨택트 인쇄를 수행하여 선 무늬 셀 접착 영역을 접시 에 인쇄합니다. 우표를 제거한 후 페트리 접시에 0.2%의 플루론 F-127 용액 4밀리리터를 채우고 한 시간 동안 배양합니다.
PDMS 스탬프의 각 면을 70%에탄올로 세 번 헹구고 공기로 말리십시오. PDMS 스탬프를 회전시키고 이전에 설명한 대로 두 번째 Petri 접시에 패턴이 없는 셀 접착제 영역을 인쇄합니다. F-127 용액으로 요리를 배양한 후, PBS로 3회, 신선한 세포 배양 배지로 3회 세척합니다.
그런 다음 접시에 세포를 씨앗, lysates를 준비하기 전에 48 시간 동안 원하는 조건에서 유지. 용액을 준비하기 위해, 2 분 동안 얼음 차가운 PBS로 세포를 씻은 다음, 80 마이크로 리터의 RIPA 용액을 추가, 원고 방향에 따라 준비, 각 세포 접착제 영역에, 25 분 동안 얼음 블록에 세포를 배양. 5 분 동안 세포 스크레이퍼로 슈완 세포를 긁어 내고 라벨이 부착 된 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 용액을 수집합니다.
1200회 G와 섭씨 4도에서 15분 동안 리세스 원심분리. 상체를 수집하고 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다. 라미닌 코팅 기판은 콜라겐과 섬유넥틴 코팅 기판에 비해 더 높은 증식율을 초래했다.
라미닌 코팅 및 다른 moduli기와 기판에 슈완 세포는 상대적으로 부드러운 기판 감소 세포 증식 속도 보여 주었다. 세포는 또한 단백질 발현을 위해 분석되었다. 전사인자 C-Jun 발현은 기판이 부드러워짐에 따라 강화되었다.
그러나, 그것은 상당히 부드러운 기판에 규제 했다. 딱딱한 기판에서 콜라겐 코팅 기판은 기판이 부드러워지면서 가장 높은 c-Jun 발현을 보였으며, 라미닌은 c-Jun의 최고 수준을 보였다. 세포는 그 때 c-Jun 발현에 있는 세포 퍼지기 및 지역 탐구하기 위하여 로다민-phalloidin로 염색되었습니다.
세포 배양기판상에서 세포 접착제선이 생성되었을 때, 패턴 기판에 시드된 세포의 핵 종횡비는 무패턴 기판에 있는 세포의 그것에 비해 증가하였다. C-Jun과 p75 neurotrophin 수용체의 발현은 더 작은 퍼진 영역을 가진 조밀한 세포에서 강화되었습니다. 선 패턴 세포는 또한 비패턴 세포에 비해 c-Jun 및 p75 NTR모두의 더 높은 발현을 초래했다.
마이크로컨택트 인쇄 셀 접착 기하학은 세포 확산 영역과 신장을 정밀하게 제어하면서 셀에서 세포 상호 작용에 대한 세포를 제거하기 위해 만들어졌습니다. 세포 종횡비를 증가시켜 핵 신장이 증가했습니다. c-Jun의 발현은 세포 신장과 세포 확산 억제모두에 의해 강화되었다.
핵과 액틴 모두에 대한 면역형광 염색은 세포 확산 영역과 신장이 이 마이크로패턴 방법을 통해 정확하게 제어되었다는 것을 확인하였다. 이 기술은 우리의 튜닝 기판을 재생 및 암의 맥락에서 슈완 세포 생물학 및 신호를 기계적으로 분석하는 방법으로 사용하는 방법을 포장했습니다.
