이 연구는 과학 진흥을 위한 일본 사회 (JSPS) 과학 연구를 위한 보조금 에 원조 17H05661 및 18K19903, 코어 2 코어 프로그램 및 AI 를 넘어서는 기관에 의해 지원되었습니다.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

이 프로토콜의 일환으로, 특허는 Jiro Kawada에 의해 설립된 직삭 생명 공학, Inc.에 허가되었습니다.

이 프로토콜은 인간 iPS 세포에서 생성된 운동 신경 스페로이드에서 확장된 축축이 있는 운동 신경 오르가노이드(MNO)의 형성을 설명합니다. 형성된 축축 묶음은 두껍고 유연하며 단방향 구조로 잘 구성됩니다. 축축묶음, 고순도 축산 단백질 및 RNA를 해부함으로써 생화학적 분석을 위해 충분히 얻을 수 있다. 신경 활동은 칼슘 화상 진찰을 가진 축산 번들 및 스페로이드에서 측정될 수 있습니다. 축 사 리자트에서 핵 및 수지상 단백질의 오염은 서양 블로팅에 의해 검출되지 않았으며, 우리의 방법은 차체및 원원에서 축축을 효율적으로 분리했다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜의 장점 중 하나는 모든 프로세스가 3D 프로토콜을 사용하여 4주 및 2D 프로토콜을 사용하여 5-6주 안에 수행될 수 있는 축축산 번들을 갖춘 MNO의 급속한 분화 및 생성입니다. 이것은 전형적으로 배아 줄기 세포 및 iPS 세포17에서 MN으로 분화하기 위하여 전형적으로 3-4 주가 걸리는 그밖 프로토콜에 비하여 짧고 축선 신장을 얻기 위하여 추가 2-4 주가 걸립니다. 3D 프로토콜은 일반적으로 2D 프로토콜에 비해 해리 단계 없이 분화 시간이 짧고 단계 수가 적고 기술 적 위험이 감소하기 때문에 2D 프로토콜보다 선호됩니다. 미세 유체 기반 조직 배양 칩은 MNS의 축축이 축축의 축축한 상호 작용과 축축 사이의 친화성을 유도하여 축축의 번들의 형성을 용이하게 마이크로 채널을 통해 다른 구획쪽으로 길게 할 수 있도록 방식으로 설계되었습니다. 간단한 실험 설정 으로 인해 여기에 설명 된 모든 프로토콜은 조직 배양 칩의 조작에 익숙한 생물 공학자뿐만 아니라 미세 유체 및 미세 제조 기술에 익숙하지 않은 생물학자 및 신경 과학자에 의해 수행 될 수 있습니다. 외부 제작 서비스를 사용하여 1단계와 2단계도 수행할 수 있습니다.
프로토콜을 수행하는 중요한 단계 중 하나는 배양 매체의 순차적 변화입니다. 소비된 매체의 요인이 MN 분화를 방해하지 않도록 분화 중에 각 단계에서 배양 배지를 완전히 변경하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 점은 미분화 된 iPS 세포를 좋은 품질로 유지하는 것입니다. 초기 iPS 세포 배양의 품질은 모터 뉴런 및 MNO를 얻기 위한 효율성에 크게 영향을 미칩니다. 또 다른 요점은 MNS의 직경이 칩 구멍의 크기(1.5mm)보다 작아야 한다는 것입니다. 더 큰 스페로이드는 챔버를 입력할 수 없으며 잠재적으로 중앙 부분에 심각한 저산소 괴사를 경험할 수 있습니다. MNS의 크기는 iPS 세포의 초기 시드 수(3D 프로토콜) 또는 모터 뉴런(2D 프로토콜)을 변경하여 제어될 수 있다. 세포의 파종 밀도는 각 iPS 세포주에 대해 최적화되어야 합니다.
마이크로그루브와 작은 모공 필터를 갖춘 구획화된 미세 유체 장치는 축축을 세포 몸과 모데라이트로부터 분리하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 기술은 또한 묶인 조직에 있는 축축의 우수한 풍부와 세포 바디 및 점원에서 축축을 분리할 수 있습니다. 다른 방법에 비해, 이 방법의 한 가지 주요 한계는 두 개의 별개의 배지를 필요로 하는 두 개의 상이한 세포의 공동 배양 능력을 방해하는 조직 배양 칩의 현재 설계에서 두 개의 상이한 배양 배지를 분리할 수 없다는 것입니다. 또 다른 제한은 PDMS 칩이 조직의 크기에 미리 정해진 제한을 두었다는 것입니다. 구멍보다 큰 스페로이드는 챔버에 들어갈 수 없으며 축축산 번들은 미세 유체 채널의 너비보다 두껍게 자랄 수 없습니다.
이 방법은 다른 유형의 뉴런에 적용할 수 있습니다. 우리 그룹은 대뇌 오르가노이드 기술(18)과결합 된 수정 된 방법을 사용하여 대뇌관을 모델링 할 수있는 능력을 보여 주었다. 피질 스페로이드는 각 구획과 축축에 자발적으로 각 스페로이드쪽으로 회기길, 그리고 그 후에 자발적으로 형성된 축축물 번들로 도입되었다. 그 결과, 2개의 피질 구엽은 축축물 번들을 통해 연결될 수 있고, 조직은 1장으로 얻어질 수 있었다. 이것은 접근이 신경 세포 모형에 관계없이 축축 묶음 조직을 형성하는 것이 매우 다재다능하다는 것을 보여줍니다. 본 프로토콜에서, 인간 iPS 세포는 사용되었지만, 인간 적인 ES 세포 및 인간 신경 줄기 세포를 포함하는 다른 줄기 세포는 제시된 프로토콜에 대한 수정과 함께 사용될 수 있다. 뉴런의 3D 스페로이드는 다양한프로토콜(19,20)에의해 생성될 수 있다. 축축물 번들로 조직을 만드는 이 방법은 3D MN 스페로이드를 만들기 위한 다른 분화 프로토콜과 미래에 잠재적으로 결합될 수 있다. 또한, 축축 묶음의 두께와 길이는 단순히 향후 개발을 위해 조직 배양 칩의 마이크로 채널의 폭과 높이를 변경하여 제어될 수 있다.
우리는 이 프로토콜이 약물 검사 및 검열에 사용될 수 있고 축축근의 발달 그리고 질병의 근본적인 기계장치의 이해에 기여할 수 있다고 믿습니다.

척추 운동 뉴런(MN)은 골격 근육에 축축을 확장하여 신체 움직임을 조절합니다. 그들의 축축궤적 궤적은 발달 과정에서 고도로 조직되고 규제됩니다. 축 사 확장 및 지침 에 많은 연구에도 불구 하 고1,조직 축 하 번 들 형성에 대 한 메커니즘은 여전히 조사. 운동 신경의 축삭은 종종 근위축성 측삭 경화증 (ALS)2와같은 신경 퇴행성 질환에 의해 손상되지만 축삭 파시클에 손상의 병리학 적 메커니즘은 제대로 이해되지 않습니다. 따라서, 축축 묶음 형성 및 회귀를 재구성하는 생리학적 및 병리학적 모델이 현장에서 요구된다.
인간 줄기세포 유래 모터뉴런은 ALS3과같은 발달 및 질병을 이해하기 위한 유망한 플랫폼이다. 인간 유도만능 줄기세포(iPS 세포)는 환자 유래 세포를 이용한 질병을 모델링하는 데 사용될 수 있다. 현재까지 만능 줄기세포로부터 MN으로의 다양한 분화 방법은4,5,6로보고되었다. 그러나, 2차원 배양에서 뉴런의 축축은 임의로 지향되며 축축이 조밀한 축축산 상호작용을 통해 단방향적으로 조립되는 신경 개발 내의 생체 내 미세환경에서 회수하지않는다. 이 문제점을 극복하기 위하여는, 인간 iPS 세포8에서운동 신경을 닮은 3차원 조직을 생성하는 기술을 개발하고, 모터 신경 오르가노이드(MNO)로 조직을 명명했습니다. MNO는 운동 뉴런 스페로이드(MNS)와 스페로이드에서 확장된 축삭 근막에 위치한 세포 체로 구성됩니다. 근막의 축삭은 단방향 지향적이며, 이는 운동 신경 개발의 축삭과 유사합니다. 따라서 MMO는 이전에 개발된 다른 뉴런 배양 방법에 의해 수행되지 않은 생리적 축축미세 환경을 독특하게 제공합니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 개발된 칩에 있는 조직 배양 칩 제조, 급속한 운동 신경 신경 분화 및 모터 신경 organoid 대형을 위한 방법을 기술합니다. 우리의 조직 배양 칩은 매우 간단하며, 그것은 단지 스페로이드를 수용하기위한 구획을 포함, 축축묶을 형성하기위한 마이크로 채널, 축축단을 하우징하기위한 구획. 이 장치는 종종 크기9,10에의해 축축과 세포 체를 분리하는 데 사용되는 마이크로 그루브 또는 마이크로 포어 필터를 포함한 복잡한 구조를 포함하지 않습니다. 따라서 포토리소그래피 설정을 사용할 수 있는 경우 이 프로토콜에 설명된 단계를 수행하여 장치를 쉽게 조작할 수 있습니다.
인간 iPS 세포의 신속한 분화는 유도 및 패터닝 인자(SB431542, LDN-193189, 망막산(RA), 그리고 매끄러운 고뇌스트(SAG) 및 가속 인자(SU5402 및 DAPT)의 최적화된 조합으로 달성된다. SU5402와 DAPT의 조합은 말초 뉴런과 신경 문장세포(11)의분화를 가속화하는 것으로 보고되었다. 이 프로토콜에서는 독자가 필요에 가장 적합한 방법을 결정할 수 있도록 MMO를 생성하는 세 가지 방법을 제공합니다. 분화된 MNS가 조직 배양 칩으로 직접 전달될 수 있기 때문에 스페로이드(3D 방법)를 형성한 후 인간 iPS 세포의 분화를 수행하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 인간 iPS 세포는 단층 (2D) 배양에서 모터 뉴런으로 분화한 다음 이전에 보고된 대로 3차원 운동 뉴런 스페로이드로 생성될 수있다 8. 우리는 프로토콜을 업데이트하고, 이 프로토콜에 설명된 3차원 분화 방법으로, 2D에서 3D로의 전환을 피할 수 있고 MMO는 짧은 분화 시간, 적은 단계 및 해리 단계 없이 기술적 위험을 감소시켰습니다. 시판되는 뉴런은 또한 분화의 시간을 줄이기 위해 MNS를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
MNO를 생성하기 위해, 우리는 조직 배양 칩에 MNS를 배양. 축축은 스페로이드에서 길게 게이트하고 축축이 모여 단방향으로 정렬되는 마이크로 채널로 확장됩니다. 이는 이러한 프로토콜에 의해 유일하게 달성되는 마이크로채널에서 축축물의 단단히 조립된 단방향 번들 조직의 축소 상호 작용 및 자발적인 형성을 용이하게 하는 반면, 자발적인 번들 형성 또는 유도축방향만으로는 다른프로토콜(12,13,14)에의해 달성될 수 있다. 일반적인 실험에서는, 몇몇 세포는 마이크로 채널로 스페로이드에서 밖으로 이동하고 대부분의 세포는 가까운 스페로이드를 유지합니다. 이 방법을 사용하면 축축을 세포 체에서 분리하기 위해 크기에 의존하는 물리적 장벽(예: 마이크로그루브 또는 마이크로포어 필터)을 사용하지 않고 스페로이드에서 자발적으로 분리할 수 있습니다.
결과 MNO는 형태학, 생화학 적 및 물리적 분석을 포함한 다양한 검사를 받을 수 있습니다. 세포 체및 확장축축묶음은 절단에 의해 물리적으로 분리될 수 있으며, 다운스트림 실험, 예를 들어 생화학적 분석 등을 위해 별도로 분석될 수 있다. RNA와 단백질을 포함하는 생물학 물질은 RT-PCR 및 서쪽 얼룩을 포함하여 정규 생화확적인 분석을 위한 단지 몇몇 축축 묶음에서 격리될 수 있습니다. 여기서는 축슨 파종의 기전과 질병을 연구하기 위한 매력적인 생리적 및 병리학적 모델을 제공하는 iPS 세포로부터 모터 신경 오르가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

축삭의 매심은 신경계에서 관찰되는 주요 구조 적분 중 하나입니다. 축 하 매심의 중단 개발 및 신경 퇴행 성 질환을 일으킬 수 있습니다. 축축의 수많은 연구가 수행되었지만, 축축기의 형성과 기능 장애에 대한 우리의 이해는 여전히 강력한 3차원 체외 모델의 부족으로 인해 제한됩니다. 여기서, 우리는 미세유체계 조직 배양 칩에서 인간 유도만능 줄기(iPS) 세포로부터 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 신속한 생성을 위한 단계별 프로토콜을 설명한다. 첫째, 방법에 사용되는 칩의 제조가 설명된다. 인간 iPS 세포로부터, 운동 신경 세포 (MNS)가 형성된다. 다음으로, 차별화된 MNS는 칩으로 전달된다. 그 후, 축삭은 자발적으로 스페로이드에서 자라서 칩에 장착된 마이크로채널 내의 근막으로 조립되어 스페로이드에서 확장된 축삭 뭉치를 운반하는 MNO 조직을 생성한다. 다운스트림 분석을 위해, MMO는 형태학적 분석을 위해 고정되거나 생화학 적 분석을 위해 해부될 칩에서 꺼내질 수 있을 뿐만 아니라 칼슘 이미징 및 다중 전극 어레이 기록을 위해 제거될 수 있다. 이 프로토콜로 생성된 MMO는 약물 검사 및 스크리닝을 용이하게 할 수 있으며 축축기 근막의 근본적인 발달 및 질병 메커니즘에 대한 이해에 기여할 수 있습니다.

운동 뉴런은 3D 분화절차(도 4 및 도 5)에서12-14일 이내에 분화되었다. 중요한 것은, 세포의 60% 이상이 분화 중에 모터 뉴런 마커 HB9를 발현하였다. 면역히스토케는 MNS내 세포의 약 80%가 SMI32 양성 운동 뉴런이었다는 것을 밝혔다. HB9 및 SMI32는 확립된 초기 단계 모터 뉴런마커(15,16)이다. HB9 및 SMI32의 발현은 모터 뉴런의 세포 정체성을 보장하기 위해 확인되어야 하는 주요 매개 변수입니다. MNS를 배양 칩에 도입한 후 축축은 채널로 확장되고 축축묶음이 형성됩니다. 물리적 가이드역할을 하는 마이크로채널로 인해 축축은 MNS로부터 길게 문어축되어 축산작용(그림6A)에의해 번들을 형성한다. MNO의 생성을 확인하기 위해서는 현미경 관찰에 의해 축축 묶음의 형성을 확인하는 것이 필수적이다. 성공적인 MNO는 50 μm보다 넓은 축축 묶음과 채널의 번들에서 분리된 축록새가 거의 없습니다. 축축의 초기 신장은 스페로이드의 도입 후 24시간 후에 관찰될 수 있다. 다음 3-4 일 이내에 축축은 마이크로 채널의 중앙에 도달한 다음 추가 10 일 이내에 다른 쪽 끝에 도달합니다(그림 6A). 결과적으로, 축축은 칩에서 2-3주 만에 직선 및 단방향 번들을 조립하고 형성했으며, 그 후 뉴런 활동이 관찰되었다.
모터 신경 오르가노이드는 생물학적 분석을 위해 현미경 유리로부터 PDMS를 분리하여 칩으로부터 수집될 수있다(도 6B). 축삭 번들 및 세포 체는현미경(도 6B)하에서수술용 칼 또는 트위저를 사용하여 절단하여 해부및 격리될 수 있다. RNA와 단백질을 포함하는 이 생물학 물질은 RT-PCR 및 서쪽 블로팅과 같은 일반적인 생화확적인 소사에 사용될 수 있습니다. MNOs의 축축번에서 핵 또는 수지상 제조 자 단백질은 서부 블로팅(도 6C)에서검출되지 않습니다.
칼슘 표시기(Fluo-4AM)와 함께 신경 활성을 조직 배양 칩에 포획할 수 있다. 스페로이드 및 축축전의 모터 뉴런의 자발적인 활성은 MNO 내에서 관찰되었다. 또한, 신경 활동은 다중 전극 어레이 시스템을 사용하여 관찰되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> 그림 1: PDMS 조직 배양 칩의 치수. (A)조직 배양 칩의 포토마스크. (B)조직 배양 칩내 마이크로채널의 치수. 모터 뉴런 스페로이드를 유지하기위한 베이스 챔버의 직경은 2mm이고 챔버 위의 PDMS의 구멍은 1.5 mm입니다. 두 챔버를 연결하는 마이크로 채널의 폭과 높이는 모두 150 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> 그림 2: 운동 뉴런 분화의 회로도 그림. (A)분화 단계는 신경 유도, 운동 신경 혈통으로 패터닝 및 운동 뉴런의 성숙을 포함했다. (B)iPS 세포로부터 운동 뉴런 스페로이드(MNS)를 생성하는 두 가지 옵션: 3D 프로토콜, 및 모터 뉴런의 해리 단계를 가진 2D 프로토콜. 모터 신경 오르가노이드 (MNO)는 두 프로토콜에 의해 얻을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> 그림 3: 지하 막 매트릭스 코팅 및 모터 뉴런 스페로이드 도입을 위한 단계별 프로토콜. (A)조직 배양 칩의 채널에서 지하 막 매트릭스 코팅. (B)MNS가 칩의 구멍에 도입. (C)지친 매체의 포부에 의한 배양 배지 변화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> 그림 4: 2D 및 3D 모터 뉴런 분화. (A)대표 3D MNS 분화(3D 프로토콜)의 시간 과정. MNS의 크기는 시간이 지남에 따라 점차 증가했습니다. 스케일 바: 500 μm. (B) -D2, D0, D1, D6, D12(2D 프로토콜)에 2D 분화의 시간 과정. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> 그림 5: 운동 뉴런의 특성화. (A)(왼쪽) SMI-32 항체 및 DAPI로 염색된 MNS의 저온절. (중간) 지하 멤브레인 매트릭스 코팅 표면에 보충된 MNS의 위상 대비 이미지입니다. 축 하 신장 관찰 되었다. (오른쪽) Synapsin I와 Tuj1 항체로 염색된 MNS의 축축. 스케일 바: 500 μm(왼쪽 및 중간) 및 50μm(오른쪽). (B)Tuj 및 HB9 항체로 면역염색된 2D 모터 뉴런의 대표적인 이미지. 스케일 바: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> 도 6: 배양 칩에서 생성된 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 특성화. (A)D32에 축축및 두꺼운 축축 묶음 형성의 대표적인 이미지. 스케일 바: 500 μm. (B)SMI-32 및 DAPI에 의한 모터 신경 오르가노이드(MNO)의 면역염색. 축삭과 세포 체는 물리적으로 절단에 의해 격리될 수 있습니다. 스케일 바: 1mm.(C)축축및 세포 체로부터 단백질의 순도는 서양 블로팅에 의해 정량화된다. MAP2, 수지상 마커, 축 산 단백질에서 검출 되지 않은 반면, 축 산 마커 Tau1 축 산 단백질에 농축. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

이 프로토콜은 조직 배양 칩에서 스페로이드에서 확장 된 축축의 강력한 번들의 자발적인 조립을 통해 인간 iPS 세포 유래 모터 신경 오르가노이드를 제조하는 포괄적 인 절차를 제공합니다.

3차원 모터 신경 오르간성 생성

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K 조회수.  The University of Tokyo. 이 프로토콜은 조직 배양 칩에서 스페로이드에서 확장 된 축축의 강력한 번들의 자발적인 조립을 통해 인간 iPS 세포 유래 모터 신경 오르가노이드를 제조하는 포괄적 인 절차를 제공합니다.

비디오: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

연구

신경과학

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

재조합 모터 영역의 광섬유 연결 : 광섬유 해부, DTI 및 3 차원 문서화 방법론

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em&gt; 히드라</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

뇌 구조의 3차원 형상 모델링 및 분석

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...