Name: generation and long-term maintenance of nerve-free hydra
Uploaded: 2017-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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저자들은 신경이없는 동물을 생성하고 유지하기위한 원래의 프로토콜에 대해 토론하기 위해 Dr. Dick Campbell (UC Irvine)에게 감사하고, 주사기와 바늘 기술을 적용하는 데 도움을 준 Rui Wang과 Danielle Hagstrom 및 Dr. Rob Steele (UC Irvine)에게 원고에 대한 의견을 말했습니다. 이 연구는 RCSA 및 NSF 보조금 CMMI-1463572에 의해 지원되었습니다.

1. 더블 콜히친 치료 <ol><li> Hydra 배지 3 , 4 , 17에 0.4 % 콜히친 (중량 / 부피) 용액을 만듭니다. 주의 : 콜히친은 급성 독성이며, 삼키면 치명적이며, 유전 적 결함을 유발할 수 있으며, 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 흄 후드에서 분말을 다루고 완전한 개인 보호 장비 (Personal Protective Equipment, PPE)를 착용하십시오. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 8 시간 동안 페트리 디쉬에 콜히친 용액 1 mL 당 5 Hydra 의 비율로 0.4 % 콜히친에서 24 시간 동안 굶어 놓은 Hydra vulgaris (AEP 균주가 여기에 사용 됨)를 품는다. 참고 : 5 Hydra / mL 콜히친은 Hydra로 접시를 과밀하게 지나치는 것을 피하기 위해 사용할 솔루션의 양을 결정하기위한 지침입니다. 이후의 세척 및 솔루션 변경에는 동일한 볼륨의 솔루션을 사용하십시오. </li><li> 콜히친 솔루션을 제거하고 교체하십시오.콜히친이없는 깨끗한 히드라 배지. Hydra 매체에서 50 μg / mL rifampicin으로 옮기기 전에 깨끗한 Hydra 배지에 유리 파스퇴르 피펫으로 직렬 전달하여 5 회 세척하십시오. 히드라 를 18 ° C 배양기에 보관하십시오. 참고 : 1-2 주간의 치료를 위해 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 충분한 1,000X 리팜피신 원료 (50mg / mL)를 4 ° C에서 저장할 수 있습니다. 정확한 양은 매일 사용되는 용액의 총량으로 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 매일 2 회 교체해야하는 10 mL의 용액을 담고있는 2 개의 접시가있는 경우, 하루에 총 40 mL의 용액이 사용됩니다 (하루에 1,000 X 재고량 40 μL 또는 하루 560 μL 2 주 동안. 그 다음에 스톡은 사용시 히드라 배지에서 1 : 1000으로 희석한다. 주의 사항 : DMSO는 가연성 액체이며 피부에 쉽게 침투하여 다른 용해 된 화학 물질이 신체에 유입되도록합니다. 손흄 후드에 솔벤트를 넣고 완전히 PPE를 착용하십시오. 참고로, DMSO는 4 ° C에서 얼게된다. </li><li> 히드라가 배지로 세포를 배출하는 것을 중지 할 때까지 매일 2 회 리팜피신 함유 하이 드라 배지를 교환하십시오. 이는 일반적으로 1 주간의 치료 후입니다. 이 시점에서 매체는 매일 한 번 변경할 수 있습니다. 치료 후 며칠 동안 히드라 는 촉수를 완전히 잃을 것입니다. 히드라 가 서로 닿아 서 서로 융합되어 이상한 모양의 히드라가 생기는 것을 피하십시오 ( 그림 2A ). <ol><li> 접촉을 방지하려면 원형 동작으로 접시를 소용돌이 치지 마십시오. 대신 히드라 가 벌어 질 때까지 접시를 수직 및 수평 방향으로 조심스럽게 흔들어주십시오. 히드라 를 18 ° C 배양기에 넣고 접시를 검사하고 필요에 따라 조정하십시오. 참고 : 매체가 두 번 변경된 날에는 매체를 변경하십시오아침에 한 번, 오후 / 저녁에 다시 한 번. </li></ol></li><li> 촉수가 형성되기 시작하면, 일주일에 3 ~ 4 회 히드라를 힘을 주어 먹이기 시작하십시오 (2 절과 3 절 참조). 콜히친 치료 후 약 8 ~ 9 일, 히드라 는 촉수를 다시 자라게됩니다. 참고 : 촉수 재성장은 개인마다 다릅니다. 일부는 촉각 증의 징후가 보이기까지 8 - 9 일 이상 걸릴 수 있습니다. 이상한 모양을 한 촉수 ( 그림 2B ) 동물이나 동물을 다시 키우지 않는 동물은 제거해야합니다. 이 히드라 는 두 번째 치료에서 살아남지 못할 것입니다. 히드라 는 또한 새싹이 날 수도 있습니다. 그러나 일부 새싹은 여전히 ​​간질 세포를 가지고 있으며 스스로 먹을 수 있습니다. <ol><li> 보조없이 먹을 수있는 모돈을 제거하고 모 동물로부터 분리하십시오. 라이브 Artemia 를먹는 요리를하고 동물들이 Artemia 를 잡아 먹는 지 관찰합니다. 1 또는 2 히드라 는 스스로 먹을 수도 있습니다. 이것도 버려야합니다. 참고 : 신경이없는 히드라 는 특징적인 풍선 모양의 형태와 정상보다 짧고 얇은 촉수 (nematocytes의 손실로 인한)를 가지므로 정상적인 동물 ( 그림 1A, 1B )과 쉽게 구분할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 콜히친 치료 후 3 주 동안 콜히친 치료를 반복하십시오 (1.1-1.5 단계). 나머지 간질 세포와 신경 세포를 제거하기 위해서는 두 번째 콜히친 치료가 필요합니다. </li></ol> 2. 강제 공급 <ol><li> Artemia 낭종을 좁은 높이의 유리 용기에 넣습니다. 용기에 Artemia water (6.72M NaCl)를 채 웁니다. Exce 피하기높은 해치 수율을 위해 물 1L 당 1g의 낭종을 수정. <ol><li> 용기의 상단을 parafilm으로 덮고 parafilm을 통해 10 mL 혈청 피펫을 용기에 넣습니다. 수족관 공기 펌프에 튜브를 연결하고 피펫 주위에 튜브를 끼워서 포기하십시오. 피펫 팁이 용기의 바닥에 도달하고 하단에 낭종이 없다는 것을 확인하십시오. 아르테미아 는 48 시간 후 부화 할 것입니다. 참고 : Artemia 를 부화하는 데는 여러 가지 방법이 있습니다. </li></ol></li><li> 아르테 미아 (Artemia) 물에서 아르테 미아 (Artemia) 물을 Artemia net (수족관 공급 업체에서 구입 가능)에 변형시키고 DI water에서 약 20 초 동안 씻어서 Hydra 배지에 넣습니다. Artemia 물의 염도가 Hydra의 경우 너무 높기 때문에 Artemia 를 사용하기 전에 세척해야합니다. </li><li> 해부 현미경으로,미세한 포셉 한 쌍으로 가볍게 짜내서 Artemia 를 안락사시킵니다. 그것이 포셉에 충실하고 먹이를 어렵게하므로 내장을 배출하기 위해 열심히 쥐어 짜지 마십시오. 히드라에 공급하기 전에 Artemia 를 가볍게 눌러 짜내면 소화 과정을 도울 수 있습니다 14 . 빠른 먹이기를 용이하게하기 위해 갓 살생 된 Artemia 를 접시에있는 Hydra 가까이에 두십시오. 참고 : 모든 후속 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다. </li><li> Peduncle에 의해 Hydra 를 잡으려면 한 쌍의 포셉을 사용하십시오. 히드라 에게 먹이를주고있는 동안 pedhencle을 계속 잡아 당깁니다 . 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여, 히드라 계약을 만들기 위해 바디 칼럼을 꼬집어 라. </li><li> 포셉의 두 번째 쌍의 끝을 함께 들고 hypostome (동물의 구강 끝에 돔형 구조)의 중심을 누릅니다. 때때로 입을 열게됩니다. 나는f 입이 두드리기에 의해 열리지 않으며 hypostome의 중앙에 포셉을 삽입하여 입을 찔러 낸 다음 포 셉터의 팁에 약간의 압력을 가하지 마십시오. 이것은 펑크로 만든 입을 펼쳐야합니다. 참고 : 입이 열리면 히드라 는 수축 및 붕괴 할 수 있습니다 ( 그림 2 C ). 이 경우 Artemia 가 여전히 Hydra에 삽입 될 수 있습니다. 그렇게하기가 어렵다면 다음 히드라 로 이동 한 다음 나중에 오리지날 히드라로 돌아가 다시 시도하십시오. 히드라 는 이후 입을 벌리는 동안 수축하지 않는 경향이 있습니다. </li><li> 포셉으로 Artemia 를 빠르게 집어 들고 Hydra 의 위장에 삽입하십시오. 위액이 가득 찰 때까지 가능한 한 많은 Artemia 를 삽입하고 Artemia 는 Hydra 를 손상시키지 않고 삽입 할 수 없습니다. 사고아티 미아를 안으로 끌어 내거나 입이 막히는 것을 방지합니다. 평균적으로, 이것은 5 - 6 아르테 미아 이지만, 최대 12 마리는 큰 동물에게 먹이를주었습니다. <ol><li> 입이 닫히기 시작하면 위에서 설명한대로 집게로 다시 엽니 다. 그러나 입안을 다시 열 때 이미 동물 내부에있는 어떤 Artemia도 나오기 시작할 수 있으므로주의해야합니다. </li><li> 히드라 가 전체 아르테미아 에게 너무 작 으면 메스를 사용하여 아르테 미아 를 잘라 내고 히드라 보다 작은 조각을 먹이십시오. Artemia 가 Hydra 안에 머 무르지 않으면 Artemia 에 대해 포셉을 눌러 입이 막힐 때까지 Hydra 안에 유지해야합니다. </li></ol></li><li> Hydra 배지에서 신선한 50 μg / mL rifampicin이 담긴 접시에 우발적 인 burping을 방지하기 위해 신중하게 유리 파스퇴르 피펫으로 먹이를 공급하십시오. Artemia 가 추방 된 경우옮기는 동안 히드라 를 씻어서 새 접시에 넣고 다시 넣으십시오. 참고 : 히드라 는 플라스틱에 비해 유리에 덜 부착되는 것으로 밝혀 졌으므로 유리 피펫을 사용하여 히드라 를 옮깁니다 . 피펫의 길이는 중요하지 않지만 5 인치 피펫을 사용하면 다소 쉬울 수 있습니다. </li></ol> 3. 버핑 <ol><li> 먹이를 마신 후 8 시간에서 20 시간 사이에 소화되지 않은 물질을 제거하기 위해 히드라 를 버프하십시오. </li><li> 팁이 평평해질 때까지 P320 또는 유사한 모래 샌드페이퍼로 30G 피하 주사 바늘을 내려 놓습니다. 참고 : 27G 피하 주사침도 작동하지만 더 높은 게이지의 작은 팁이 좋습니다. </li><li> 일회용 1 ML 플라스틱 주사기에 바늘을 연결하고 Hydra 매체에 신선한 50 μg / ML rifampicin와 주사기를 채 웁니다. 참고 : 단일 히드라를 버핑하는 데는 약 0.05 mL ~ 0.1 mL의 용액이 필요합니다. 1 mL syri더 큰 용량의 주사기를 사용하면 나오는 용액의 힘 및 부피를 제어하기가 더 어렵 기 때문에 바람직하다. </li><li> 해부 현미경에서, 미세 포인트 포 셉과 Hydra 의 peduncle 잡고 바늘 hypostome의 중심에 누릅니다. 입이 열리지 않으면 hypostome에 포셉을 넣고 위의 설명과 같이 입을 벌리십시오. 참고 : 모든 후속 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다. </li><li> 모든 잔해가 제거 될 때까지 전체 동물, 50 μg / ML rifampicin 솔루션 위장을 멀리 불어 피하기 위해 매우 부드럽게 플러시하는 주사기를 사용하십시오. 히드라 의 크기가 허용하지 않으면 반드시 바늘을 히드라에 삽입 할 필요는 없습니다. 바늘은 입 개구에 가깝게 유지되고 입쪽으로 직접 향하게 될 수 있습니다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새우 50 개가 담긴 접시에 이드 라 를 옮겼습니다.81; g / mL rifampicin ( Hydra 배지). </li></ol> 4. 면역 조직 화학을 통한 품질 관리 참고 : 다음 프로토콜은 Shenk, M. A, et al. 18 절 , 벧 거어, 19 장 . 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온 (RT)에서 수행됩니다. 배양 단계에 nutator를 사용할 수 있으며 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 히드라 가 서로 얽혀 있으면 모든 단계가 없이도 수행 될 수 있습니다. <ol><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 인산염 완충 식염수 (PBS)에 1 % DMSO를 차단 용액을 준비합니다. 이 용액을 사용하기 전까지 4 ° C에서 보관하십시오 (4.6 및 4.11 단계). 용액은 1 ~ 2 일 동안 보관할 수 있습니다. 참고 : 이 프로토콜에 사용 된 모든 솔루션은 위험 폐기물로 올바르게 수집해야합니다. </li><li> 히드라 에서 2 % 우레탄 200 μL로 히드라 완화1.7 mL의 마이크로 원심 분리기 튜브에서 1 분간에 듐. 신경 조건이없는, 치료되지 않은, 일차 항체가없는 상태에서 치료받지 않은 상태, 이차 항체가없는 상태에서 튜브 당 5 Hydra를 사용하십시오. 참고 : 1 분을 초과하지 마십시오. 우레탄에 너무 많은 시간을 소비 한 후에 동물의 상태가 좋지 않기 때문에 여기에 타이밍이 중요합니다. </li><li> 우레탄을 제거하고 15 분 동안 Hydra 배지에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 200 μL로 히드라 를 고정시킨다. </li><li> 각 10 분 1X PBS로 샘플을 3 번 씻으십시오. 참고 : PBS와 PBSTx로 모든 세척은 500 μL의 용액으로 이루어집니다. </li><li> 15 분 동안 PBS에 0.5 % Triton X-100 500 μL로 침투. </li><li> 0.5 % 트리톤 X - 100을 제거하고 차단 솔루션 500 μL를 추가합니다. 최소 1 시간 동안 시료를 차단하십시오. </li><li> 항 - 티로신 - 튜 불린 항체를 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석한다. 주 : 이 농도는 de실험적으로 종료되었습니다. 컨트롤의 신호가 너무 약한 것으로 밝혀지면 농도를 높여야 할 수 있습니다. 비특이적 결합이있는 경우, 농도를 낮추어야 할 수도 있습니다. 항체의 사전 배양은 또한 비특이적 결합을 감소 시키는데 도움을 줄 수있다. </li><li> 샘플에서 차단 솔루션을 제거하고 신경이없는 히드라 , 치료되지 않은 컨트롤 및 보조없이 치료되지 않은 컨트롤에 기본 항체 200 μL를 추가하십시오. 1 차 처리가없는 미처리 대조군의 경우 항체가없는 200 μL의 차단 용액 만 첨가하십시오. </li><li> 4 ° C에서 밤새 (&gt; 12 시간) 샘플을 품어 낸다. 참고 : 또는 RT에서 5 ~ 6 시간 동안 배양하십시오. </li><li> 일차 항체를 제거하고 1x PBS (PBSTx)에서 0.3 % 트리톤 X - 100로 광범위하게 샘플을 씻으십시오. 참고 : 2 ~ 3 회 이상 재사용 할 수 있으므로 1 차 항체와 저장 물을 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 염소 항 마우스 hP 2 차 항균 희석1 : 500의 블로킹 용액. 신경이없는 히드라 , 치료되지 않은 대조군 및 치료되지 않은 대조군에 200μL를 추가하십시오. 2 차 처리가없는 미처리 대조군의 경우 항체가없는 200 μL의 차단 용액 만 추가하십시오. 주 : 또는, 형광 이차 항체를 사용할 수 있으며, 4.13 - 4.17 단계가 필요하지 않습니다. 형광성 이차를 사용하면 시간이 절약되고 일반적으로 적절하지만 hP 보조는 민감도가 증가합니다. 이차 농도는 실험적으로 결정되었다. 대조군의 신호가 너무 약한 것으로 밝혀지면 농도를 증가시켜야 할 수도 있습니다. 비특이적 결합이있는 경우, 농도를 낮추어야 할 수도 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 밤새 샘플을 배양하십시오. </li><li> 이차 항체를 제거하고 PBSTx로 광범위하게 샘플을 씻으십시오. </li><li> 1x PBT에서 0.2 % 소 혈청 알부민 (체중 / 부피), 0.05 % Tween20을 준비하십시오. s를 품어 라.30 분 동안 1x PBT의 양. </li><li> 1x PBT를 제거하고 어둠 속에서 15 분 동안 1x PBT에서 1 : 1,000 NHS- fluorescein과 1 : 10,000 H 2 O 2 에 시료를 품을 것. 이 단계에서 형광 신호가 빛에 노출 될 때 형광 신호가 감소하므로 샘플을 최대한 어둡게 유지하십시오. 주 : NHS- 플루 오레 신은 King, RS 및 Newmark, PA 20에 의한 상세한 FISH 프로토콜에 따라 제조되었다 </li><li> PBSTx로 3 번 빠르게 씻은 다음 30 분 동안 2 번 씻으십시오. </li><li> 4 ° C에서 밤새 PBSTx에 샘플을 남겨두고 세척을 계속하십시오. </li><li> 1x PBSTx로 몇 번 더 세척하십시오. 세포핵을 시각화하려면 4 &#39;, 6-diamindino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)를 사용하여 DNA 대조 염색을 위해 다음의 선택적 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 샘플을 이미징 할 수 있습니다. </li><li> PBSTx에서 작업 농도 1 : 500으로 5mg / mL DAPI 스톡을 희석하고 각 튜브에 200 μL를 첨가합니다. 인큐샘플을 30 분 동안 말리십시오. 주의 : DAPI는 알려진 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. </li><li> 형광 현미경으로 이미징하기 전에 DAPI를 제거하고 샘플을 PBSTx로 2 ~ 3 회 씻으십시오. </li></ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이드 라 간질 세포는 이중 콜히친 치료를 통해 제거 할 수 있습니다 3 , 4 . 첫 번째 치료를 한 다음날에는 히드라 조각이 변형 된 히드라와 융합되는 것을 피하기 위해 개별 히드라 간의 접촉을 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 두 번째 콜히친 치료는 그러한 동물에서 잔여 간질 세포를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으므로,...

히드라 의 신경계는 상피 조직층과 관련된 뉴런과 함께 신경 네트로 구성됩니다 1 . 신경망은 hypostome과 peduncle에서 밀도가 높고 body 칼럼 2 에서는 밀도가 낮습니다. 신경 세포는 분비 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 뉴런을 생성하는 다 능성 줄기 세포 인 간질 줄기 세포에서 기원합니다 1 . 분열 된 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 3 , 4로 처리하여 히드라 분비 선의 간질 세포를 제거 할 수 있습니다. colchicine이 다른 유기체에서 미세 소관의 중합을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 이전의 연구에 따르면 microtubules은 Hydra 3 에서 전체적으로 콜히친이 이런 작용을하지 않는다는 것을 시사하는 전체 치료 과정에서 Hydra 에 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 또 다른 성udy는 Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas 및 Schizosaccharomyces pombe를 포함한 일부 유기체에서 콜히친이 tubulin에 효율적으로 결합하지 않는다고 제안하는데 , 이는이 차이를 설명 할 수있다. 콜히친 치료는 내배엽 상피 세포에 의한 간질 세포의 식균 작용을 유도하므로 신경 세포, 간 세포 및 혈구 세포가 결핍 된 동물을 만들 수 있습니다. 간질 세포가 콜히친 치료에 특히 민감한 이유는 분명하지 않습니다. 사후 mitotic interstitial cell과 interstitial stem cell lineage가 모두 손상되고 탐식 된 것을 감안할 때, Campbell은 콜히친이 유사 분열 활성에 직접적으로 영향을 미치지 않는다고 결론 지었다 3 . 특히, 콜히친 치료는 히드라 vulgaris 에서 잘 작동하지만 Hydra oligactis 6 와 같은 다른 종에서는 효과가없는 것으로 나타났습니다 . </colchicine과 hydroxyurea로 변형 된 치료는 신경이없는 Hydra viridis 7 을 생산하는데 사용될 수 있습니다. 신경이없는 히드라 (때로는 &quot;상피 히드라 &quot;라고도 함)는 조직 항상성과 재생에서 간질 세포 계통에서 이러한 특수 세포 유형의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 히드라 는 신경계없이 살 수있는 동물의 유일한 예일 수 있습니다. 신경이없는 히드라 는 히드라 재생, 항상성 및 행동을 조절하는 신경 망의 역할을 분석하는 데 특히 유용한 모델입니다. 예를 들어, 간질 세포를 이식을 통한 신경없는 히드라 로 도입하면 신경 세포 분화의 특성을 고도의 부위 특이 적 특성으로 인정할 수 있었다. 또한, 신경이없는 히드라 가 재생할 수 있기 때문에, 그들은대안적이고 신경계에 독립적 인 재생 경로를 조사 할 수 있습니다. 하나의 그러한 예는 apical neurogenesis와 head formation이며, 이것은 wild type Hydra 의 신경계에서 cnox-2 기능에 의존하는 것으로 나타 났지만, 신경이없는 Hydra 에는 필요하지 않은 것처럼 보이며, 대체 머리 재생 과정이있을 수 있음을 시사한다 10 . 신경이없는 히드라 는 또한 신경 발생을 상실한 후에 신경 세포와 신경 전달 유전자의 상피 세포 발현과 조절을 연구하는데 사용되어왔다. 신경이없는 히드라 는 자발적인 수축 버스트 12를 나타내지 않으며, 이는 이러한 버스트가 신경계에 의해 조절된다는 것을 나타냅니다. 그러나 신경이없는 히드라 는 신체 칼럼을 집게로 꼬집는 것에 반응하여 기계적 자극에 반응하는 수축이 커플 링에 의해 매개되는 것으로 나타났습니다gh 갭 접합부를 형성하는 반면, 자연적 수축 작용은 신경 세포의 갭 접합부를 통해 커플 링 됨으로써 매개된다. 신경이없는 히드라 는 음식이나 감칠맛이있는 글루타티온 3을 선물로 먹었을 때 입을 열지 않아 음식의 존재를 감지하고 입을 열어야한다는 감각 뉴런이 필요합니다. 또한, 신경이없는 동물은 입안을 통해 내부 정압을 자율적으로 조절할 수 없기 때문에 삼투압을 감지하는 역할을하는 것으로 보이며, 풍선 모양과 같은 모양을 띄게됩니다 ( 그림 1B ). 신경 수분이없는 히드라 의 수압을 수동으로 수축 시켜서 수압을 조절하면 hypostome과 body column의 비정상적인 형태가 손실됩니다. 그러나 만성적 인 디플레이션은 성장에 대한 간섭으로 이어졌다.구성, 출생 및 조직 구성 8 . 신경이없는 히드라 는 스스로 먹일 수는 없지만 실험실에서 각 동물을 수동으로 강제로 먹이고 버핑하여 무한히 유지할 수 있습니다. 이전의 간행물은 힘을 먹이는 방법과 신경이없는 히드라를 트랩하는 방법을 설명했지만, 이러한 프로토콜은 적절한 크기로 조심스럽게 잡아 당겨야하는 마이크로 피펫 팁과 튜빙 14로 피펫에 연결된 마우스 피스를 사용해야합니다. 여기에서는 더 간단하고, 안전하며, 시간이 절약되는 사료 공급과 버핑 방법이 설명됩니다. 또한 이전 연구에서는 고정 된 동물을 개별 세포로 분리하고 세포 형태학을 검사하여 신경 세포의 부재를 확인하는 것이 포함되었습니다 3 , 4 , 15 . H예를 들어 알파 - 튜 불린의 티로신 화 된 카르 복실 말단에 대한 단일 클론 항체를 이용한 면역 조직 화학 염색을 hypostome 13 , 16 에서 뉴런의 고갈 여부를 확인하기위한 연쇄 반응의 보완적인 방법으로 사용했다. 이전 연구에서 보듯이 peduncle의 뉴런도이 항체 13을 사용하여 시각화 할 수 있지만,이 뉴런뿐만 아니라 신체 칼럼의 뉴런도 만들어내는 것이 더 어렵습니다. immunohistochemistry hypostome에 신경 세포의 부재를 확인하는 데 충분하고 세포 유형의 형태에 대한 전문 지식을 필요로하지 않지만, 그것은 간질 줄기 세포와 이러한 세포의 다른 파생물의 부재를 확인하는 데 사용할 수 없습니다. 해리 및 세포 형태학 연구는보다 엄격하며 치료의 각 단계 이후에 남아있는 각 세포 유형의 수를 정량적으로 설명 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Colchicine</td><td>Acros Organics</td><td>227120010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>BD</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp Eggs</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td>Can be purchased locally</td></tr><tr><td>Brine Shrimp Hatchery Dish</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 3/4&quot; Hypodermic Needle</td><td>Covidien</td><td>1188830340</td><td>A 27G needle may also be used</td></tr><tr><td>2 x Fine-tip Tweezers</td><td>Dumont</td><td>0109-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>EMD Millipore</td><td>557303</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)</td><td>Enzo</td><td>ADI-SAB-100-J</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP9703-100</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher</td><td>08-920A</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>MP Bio</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T9028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X - 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Air Pump</td><td>Tetra</td><td>77846-00</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipette</td><td>VWR</td><td>53283-916</td><td>Length of the pipet does not matter</td></tr><tr><td>15 mL Tube</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>P320 Sandpaper</td><td>3M</td><td>IBGABBV00397</td><td>Can be purchased at local home improvement store</td></tr></tbody></table>

generation and long-term maintenance of nerve-free hydra

히드라 의 간질 세포 계통에는 다 분화능 줄기 세포와 그 파생물이 포함됩니다 : 샘 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 신경 세포. 간질 세포는 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 (collicicine)을 2 회 연속 처리하여 제거함으로써 간질 줄기 세포에서 유래 한 분화 세포의 재생 가능성을 없앨 수 있습니다. 이것은 신경 세포가 부족한 히드라 의 생성을 가능하게합니다. 신경이없는 폴립은 삼투압을 공급, 제거 또는 조절하기 위해 입을 열 수 없습니다. 그러나 그러한 동물은 규칙적으로 강제로 먹이를 먹이고 짐을 싣기 만하면 생존하고 실험실에서 무기한 배양 될 수 있습니다. 신경 세포가 부족하여 동물 행동과 재생을 조절하는 신경계의 역할을 연구 할 수 있습니다. 신경이없는 히드라 유지를 위해 이전에 발표 된 프로토콜에는 손으로 뽑은 마이크로 피펫을 사용한 구강 (mouth-pipetting)히드라 를 먹이고 닦으십시오. 여기서 신경이없는 히드라 유지를위한 개선 된 프로토콜이 소개됩니다. 잘게 썰린 집게는 강제로 입을 열고 갓 죽인 아르테 미아 (Artemia)를 삽입하는 데 사용됩니다. 강제 공급 후 동물의 체강을 시린지와 피하 주사침을 사용하여 신선한 배지로 씻어내어 소화되지 않은 물질을 제거합니다. 여기서는 &quot;burping&quot;이라고합니다. 포셉과 주사기를 사용하여 힘을 공급하고 신경이없는 히드라 를 버핑하는이 새로운 방법은 손으로 뽑은 마이크로 피펫 팁을 사용하는 입 피펫팅의 필요성을 없애줍니다. 따라서 프로세스를보다 안전하고 훨씬 더 효율적으로 만듭니다. hypostome의 신경 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 anti-tyrosine-tubulin을 이용한 면역 조직 화학 법을 시행합니다.

초기 8 시간 콜히친 치료 직후 모든 히드라는 생존합니다. 이 히드라 중 일부는 촉수 스텁을 남기고 ( 그림 3A ), 나머지는 촉수를 완전히 잃을 것입니다 ( 그림 3B). 다음 1 또는 2 일 동안, 촉수는 모든 히드라 가 촉수를 잃을 때까지 계속 줄어들 것입니다. 치료 후 약 일주일 후 Hydra 는 촉수가 완전히 재?...

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Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다.

신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em&gt; 히드라</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

generation-and-long-term-maintenance-of-nerve-free-hydra

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

12.5K 조회수.  UC San Diego.  colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다. 

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Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

작은 별 말미의 반구 Physa에서 전체 폴립 재생을 유도<em&gt; Nematostella의 vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

연구

발생학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

신경과학

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

생체공학

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

형광 현장 혼성화 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 표지 수중동물 해파리 클라도네마 파시피쿰에서 줄기 유사 세포

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

형질 전환의 세대<em&gt; 히드라</em&gt; 배아 미세 주입에 의해

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 뇌실하 영역에서 분리된 NSC의 효율적인 핵 분석

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Improved Nucleofection for High-Efficiency Gene Delivery in Murine Subventricular Zone-Derived Neural Stem Cell Cultures

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

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