Name: protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes
Uploaded: 2015-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

The authors have nothing to disclose.

본 연구는 의료 과학이란 대학의 윤리위원회 (테헤란,이란)의 승인을 실험실 동물의 관리 및 사용 (NIH)에 대한 설명서에 명시된 정책에 따라 실시 하였다. 1. 동물, 수술 및 시료 준비 참고 : 3D 공 초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다. <ol><li> 두 그룹으로 무작위로 나누기 동물 : Aβ 1-40 -injection (N = 8)과 제니스 타인 처리와 Aβ 1-40 -injection (N = 8); 수술 전 위관 1 시간으로 제니스 타인 (예 : 폴리에 피마 자유 등의 차량에 희석하여 10 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취. 발가락을 곤란하게 한 후 철수 반사의 부족으로 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용합니다. </li><li> 정위 장치 및 면도 헤드에서 동물을 놓습니다. IOD 적용오프라인 용액 두피 절개 전에 청소 및 감염의 위험을 최소화하기 위해 수술 중 무균 조작 위치를 유지한다. 쥐의 뇌 아틀라스 8 항에있어서, 브레 그마에 -3.5 mm 후방, 중간 선에 ± 2mm 측면 및 경막 아래 -2.8 mm의 해마에서 아밀로이드 베타 1-40 stereotaxically (4 μL)를 주입한다. 정위 방법은 이전의 출판물 (9)를 참조하십시오. </li><li> 동물은 동물의 편안함을 보장하기 위해 완전히 의식 때까지 수술 후 관찰 / 치료를 제공합니다. 복구하는 동안 따뜻한 동물을 유지하고, 완전히 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에게 반환하지 않습니다. 수술 후 동물에서 감염의 징후에주의를 기울이십시오. </li><li> 삼주 수술 후 케타민 (150 ㎎ / ㎏)에 의해 깊이 동물을 마취. 0.1 M PBS (PH = 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드 다음에 0.9 % 식염수 동물을 관류하여 transcardial 고정을 수행 한 후 제거하고 10에 기술 된 바와 같이 &lt;뇌를 해결/ SUP&gt;. </li><li> 4 ℃에서 2-3 일 동안은 4 % 파라 포름 알데히드의 머리를 포스트 - 수정. </li><li> 조직 포함 장비를 이용하여 파라핀 블록에서 조직을 포함, 그것은 올바른 정렬 또는 절편을 방해 할 수 있기 때문에 충전 언더 또는 오버 충전 카세트를 피할 수 있습니다. 파라핀 블록에서 조직의 방향에주의를 기울이십시오. 주 : 래트 해마는, 예를 들어 대뇌 반구의 후방 부에 가깝다. 따라서, 조직이 방법에 포함되어야 뇌의 후방 부에서의 단면 처리가 시작될. 원하는 해부학 적 구조에 도달하는 가이드로 Paxinos 아틀라스 (8)을 사용합니다. </li><li> 공기의 움직임이 어려운 부분의 취급을하기 때문에 멀리 공기 초안 또는 출입구에서 마이크로톰을 놓습니다. </li><li> 이 깊이가 필요한 경우와 마찬가지로 완전한 성상 세포의 Z - 스택 이미지를 생산하기 위해 두께 ≥20 μm의와 섹션을 사용합니다. 그들이 원하지 않는 두께를 가질 수있다로 인해 열 전자에, 처음 몇 섹션을 사용하지 마십시오xpansion. </li><li> (5 ± 2 C, 파라핀의 용융 온도 이하) 단지 충분히 부분을 평평하게 따뜻한 물 표면에 섹션을 놓습니다. 주 : 섹션의 확장 구조의 형태를 교란 할 위에. 신중하게 섹션을 전송하는 작은 붓을 사용합니다. 각 슬라이드에 2-3 섹션을 수집합니다. </li><li> 저장 수직 위치에서 랙에 슬라이드와 몇 시간 또는 O / N 37 ℃에서 그들을 건조 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 면역 조직 화학 <ol><li> Deparaffinize 크실렌 섹션, 2 × 10 분, 알코올 그라데이션을 통해 (99.8 %, 95 %, 70 %, 10 분마다) 및 PBS를 재수. </li><li> 0.25 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.25 % 트리톤 X-100 및 3.5 % 정상 혈청 (4 ℃에서 O / N)를 함유하는 PBS로 1,500 : 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)에 대한 항체와 함께 인큐베이션 1 희석. </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 이차 알칼리성 인산 공역 antibodie으로 부화1 시간을위한 S (1 : PBS에 희석 (100), 21 ˚C). </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS의 섹션을 씻으십시오. 참고 : 배경 염색을 최소화하기 위해 이차 항체 후 제대로 부분을 세척하는 것이 중요합니다. </li><li> 액체 영구 레드 발색 (15 ~ 20 분)와 함께 어둠 속에서 섹션을 품어. 참고 : 사용하기 전에 더 이상 30 분 솔루션을 준비합니다. </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 마지막으로, 4-6-diamidino -2- 페닐 인돌과 핵 염색 (DAPI를 1 : PBS에 희석 500) 이전에 다루-미끄러 할 수 있습니다. 현미경 전에 냉장고에 24 ~ 48 시간에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 3. 공 초점 현미경 주 : 정량적 평가 (아래 참조), 오류의 위험을 줄이기 위해 분기 겹치는 최소 명확하게 볼 DAPI로 핵 염색 성상 세포를 선택한다. Z 스택 이미지를 생산하는 것은 시간이 소요됩니다. 환자 수 및 처리하는 동안 중지하지 마십시오. 직립 공 초점 레이저 주사 현미경은 U 인성상 세포에서 3D 이미지를 만들 나오지. <ol><li> 현미경 단계에 슬라이드를 넣고 63X 목표를 선택합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 열고 시작 시스템을 클릭합니다. 찾기 탭을 클릭합니다. 할당로 이동, 적절한 빛을 조정 GFP를 선택합니다. </li><li> 빛을 반영하기 위해 셔터를 엽니 다. 셔터의 오른쪽에있는 반사경 리볼버를 찾아 성상 세포 (녹색, 빨간색이나 보라색)에 의해 반영되어야 색상을 선택; (FSet20의 WF) 붉은 색은 여기에 사용되었다. 참고 : 현미경의 안구에 직접 사진을 집중하는 것을 잊지 마십시오. </li><li> 최적의 초점을 찾으려면, 모든 닫힌 클릭 화면 모드에서 현미경 핀을 넣어 취득 탭을 클릭합니다. </li><li> 인수 탭에서 스마트 설치를 클릭; 창이 열립니다. 목록에서 (현재 프로젝트 즉, DAPI와 알렉사 플 루어 555) 적절한 형광을 선택합니다. 색상이 자동으로 선택됩니다. </li><li> 최고의 신호를 클릭하고 적용을 한 후 설정 노출 클릭; 컴퓨터가 자동으로 노출 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 이미지를 최적화하기 위해, 채널 창으로 이동합니다. 표시 해제 트랙 2는, 트랙 1을 선택하고 라이브를 클릭합니다. 필요한 경우 이미지에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 채널 창에서 다음 키를 조정; 자동으로 핀홀을 최적화 할 수 1AU을 클릭합니다. 그렇지 않으면 공 초점 영상이 최적이 될 것이다이 단계를 수행하는 것이 매우 중요합니다. 최고의 강도를 (추가 소음을 줄이기 위해 800 아래이 설정을 유지)하도록 게인을 조정합니다. 마지막으로, 2와 3 사이의 디지털 게인을 설정합니다. </li><li> 표시 해제 트랙 1은 트랙 2를 클릭하고 트랙 2에 대한 단계 3.8를 반복합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다. </li><li> 획득 모드 창으로 이동합니다. 프레임 크기를 최적화하고 평균하여 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 변경하려면 프레임 크기는 X * Y에 가서 X 1,024 1,024을 선택합니다. 더 나은 이미지를 만들 느린 속도를 선택합니다. </li><li> 평균화로 이동하여 번호를 ≥4 선택합니다. 이 값은 평균 생산은 평균화 될 스캔의 수를 나타낸다획득 한 이미지를 이메일. 이제 스냅 버튼을 클릭하고, 촬영 된 2D 이미지를 저장합니다. </li><li> 3D 영상의 경우, Z-스택 창을 엽니 다 원인이 스마트 설치의 Z-스택 항목을 표시합니다. </li><li> 셀의 깊이, 즉, Z-스택에 대한 첫 번째 및 마지막 위치를 설정한다. 첫 번째 라이브를 클릭합니다. 그런 다음 Z-스택 시작하는 것입니다 조직 성상 세포의 최상 위치에 초점 현미경의 초점 드라이브를 사용합니다. 설정 먼저 클릭합니다. 그리고 Z-스택 검색이 중지해야 조직의 성상 세포의 가장 낮은 위치에 아래로 초점을 맞 춥니 다. 설정 마지막을 클릭합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다. </li><li> 간격을 선택; 1.01 μm의 현재 연구에 사용되며, 선택 간격은 슬라이스의 개수를 설정하는 최적 클릭함으로써 이루어질 수있다. </li><li> 시작 실험을 클릭합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 표면적 및 성상 세포 영역의 용적, 전체 성상 세포를 포함 브래지어 :이 이미지는 다음과 같은 파라미터의 측정에 사용한다nches, 세포체 및 핵. </li><li> 단계 3.6에서 3.11 사이에 기술 된 바와 같이 또는 10X 20X 대물 렌즈를 이용하여 2 차원 화상을 취득. 이 이미지는 측정 된 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개수 / 1,000 ㎛의 2)의 강도를 이용할 수있다. </li></ol> 4. 성상 세포 밀도와 GFAP + 형광 강도 <ol><li> 20X 2D 이미지를 엽니 다. 이미지 창 왼쪽에있는 히스 (Hisogram)을 클릭합니다. </li><li> 성상 세포 밀도를 계산하려면, 20X 목표 아래 세 개의 연속 시야를 선택합니다. 필드에 지점을 중복, 최소 명확한 소마을 나타내는 성상 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 형광 강도를 정량화하기 위해, 이미지 윈도우의 바닥 글에 적절한 도구 (사각형 또는 원형)을 선택하고, 측정 영역을 선택합니다. 평균값과 표준 편차에 따라 자동으로 표시 이미지 참고. STR 간의 현재 연구에서, 0.7 mm의 직사각형 영역 (2)iatum 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 내측 블레이드를 사용 하였다. </li></ol> 5. 성상 세포 지점 <ol><li> 분기의 길이와 수를 정량화하는, 화상 해석 소프트웨어 (20X으로 얻은) 3D 이미지를 사용한다. 선택한 성상 세포의 각 지점의 길이를 따라 수동으로 선을 그립니다. 그런 다음 라인 길이를 측정하는 전문 측정 툴을 선택합니다. 분기의 수를 정량화하기 위하여, 표시 항목의 수를 카운트하는 카운트 수단을 선택한다. </li></ol> 6. 볼륨 및 표면적 참고 : 3D 이미지 분석 소프트웨어에서 수동으로 구조를 표시 초점과 훈련을 필요로한다. 실험을 시작하기 전에 몇 번 연습. <ol><li> 성상 세포의 핵, 소마, 세포체와 영토의 부피와 표면적을 정량화하기 위해, 같은 Volocity 6.1로 3D 이미지 분석 소프트웨어 (단계 3.1-3.16에 인수) 3D 이미지를 전송합니다. </li><li> 소프트웨어를 열고 새로 만들기도서관. 새 라이브러리에서 왼쪽 회색 컬럼에 모든 이미지를 드래그합니다. 그런 다음, 하나의 3D 이미지를 선택합니다. 오른쪽에, 다른 색상으로 다른 채널이 있습니다. 관심의 한 채널을 켜십시오; 예를 들어 DAPI에 대한 파란색 채널은 핵을 측정 할 때. 최적의 대비를 얻기 위해 수동으로 밝기를 변경합니다. </li><li> [도구] 메뉴를 선택, 볼륨을 확인하고 Z 스택 이미지에서 하나의 3D 이미지를 생성로 이동합니다. 편집 메뉴에서 속성을 클릭하고 X는, Y 및 Z 속성이 제시되어 있는지 확인; 그렇지 않으면 차원 분석을 수행하는 것이 불가능하다. </li><li> 도구 모음에서 자유형 RIO 도구 아이콘을 클릭합니다. 성상 세포 핵의 부피와 표면적을 측정하는 것은 DAPI 표지 된 핵 주위에 선을 그린다. </li><li> 성상 전지 본체의 부피와 표면적을 측정하는 것은 분기 제외한 주위 소마 선을 그린다. </li><li> 전체 성상 세포 (지점 포함 세포체)의 부피와 표면적을 측정하려면 다음 소마 주위에 선을 그립니다모든 지점의 표면. </li><li> 성상 세포 영토의 부피와 표면적을 평가하는 것은 가지의 팁 사이에 선을 그립니다. 참고 : 눌러 원하지 않는 그림을 지울 키보드 삭제합니다. </li><li> 측정 프로토콜을 만들 수있는 이미지 창 상단의 측정 메뉴를 클릭; 다른 도구를 포함하는 창이 열립니다. </li><li> 드래그는 윈도우 (창)의 상단에 개체를 찾을 수 있습니다. , 인구 1로 설명하는 이름을 부여 관련된 색상을 선택하고 측정을 클릭합니다. 또 다른 창이 열립니다. </li><li> 매개 변수 즉, 볼륨 또는 표면 영역을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 데이터는 테이블에 나타납니다. </li><li> 측정 메뉴에서 데이터를 클릭 저장 및 측정 항목 만들기를 선택합니다. </li><li> 열린 창에서 호출 새로운 측정 항목을 선택합니다. 그런 다음 데이터에 이름을 지정하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 마지막으로, 그래프 패드로 통계 소프트웨어로 데이터를 내보내거나 프로그램을 엑셀. 데이터를 분석하는 t 테스트를 사용하여 다음 2D GR 플롯aphs. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

이 작품은 의료 과학 대학이란 (테헤란,이란)에서 외스 테르 예틀 란드의 지방 협의회, (스웨덴)과 세포 및 분자 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.

현재 프로토콜에서, 우리는 성상 세포의 형태와 관련이 있었다 (12) 다른 매개 변수를 평가하는 3D 공 초점 형태 계측을 고용했다. 이러한 목적을 위하여, Aβ 1-40와 쥐의 해마 조직 - 또는 소염제로서 게니 전처리없이 유도 astrogliosis가 사용되었다. 3D 이미지 및 형태 계측 학적 소프트웨어를 사용하여, 우리는 아스트로 사이트의 형태 즉 astrogliosis에 제니스 타인 효과를 표시 할...

건강한 중추 신경계 (CNS)에서 별아교 세포는 혈류, 에너지 대사, 시냅스 가소성과 기능 및 세포 외 이온의 조절에 중요한 역할을하는 신경 전달 물질 및 1-3 항상성. 또한, 성상 세포는 다른 유해한 자극 및 비대, 증식 및 성상 세포 4,5의 기능 리모델링을 특징으로 반응 astrogliosis을 통해 외상, 감염, 허혈 또는 ​​신경 퇴행과 같은 비정상적인 상태에 응답합니다. 반응성 astrogliosis은 치료 개입의 임상 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 조직에 염증 반응 및 복구 과정을 설계하고있다. 따라서, 성상 교세포는 중추 신경계에 영향을 미치는 질병의 다양한 치료 적 개입에 대 한 잠재적 인 대상으로 지난 수십 년 동안 신경 과학자로부터 주목을 받았다. 성상 세포는 일반적으로 잘-D와 별 모양이소마 6 퍼져 efined 가지. 뇌 질환 상태에서, 성상 세포는 복잡한 분기되고 베타 아밀로이드 (Aβ)의 존재하에, 예를 들면 팽윤 (7) 단부를 나타낸다. 이 문서에서는 공 초점 현미경으로 인수 성상 세포의 3D 이미지를 분석하기위한 프로토콜을 제공합니다. 각 성상 세포에 대한 정량적 십이 다른 파라미터를 측정 하였다 : 표면적 및 성상 세포의 영역 (성상 세포에 의해 덮여 조직), (분기 포함) 전체 셀, 전지 본체, 및 핵의 양; 총 길이와 가지의 수; 성상 검출에 사용되는 항체의 형광 강도; 및 성상 세포의 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2). 이를 위해, 우리는 함께 또는 항 염증 물질로서 게니 처리없이 Aβ 1-40의 주입 intrahippocampal 노출 래트에서 뇌 부분을 사용 하였다. 설명 프로토콜 형태 계측에 사용될 수있다시험 관내 또는 생체 내에서 서로 다른 조건에서 다른 세포 유형의 alysis.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

뇌 신경 교세포 같이, 성상 세포는 중추 신경계에서의 다양한 기능적 역할이있다. 유해 자극의 존재에서, 성상 세포는 기능 및 구조적 특성, 반응 astrogliosis라는 조건을 수정합니다. 여기에, 성상 세포의 형태 학적 특성 평가를위한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 지점 표면적 및 성상 세포 (성상 세포 지역)에 의해 덮여 조직, 지점, 전지 본체와 핵을 포함하는 전체 성상 세포의 부피, 즉 12 가지 파라미터 부량뿐 아니라 전체 길이 및 개수를 포함하는, 강도 성상 검출에 사용되는 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2)의. Volocity 6.3 측정에 사용 된 것처럼이 목적을 위해 3 차원 (3D) 공 촛점 현미경 이미지를 생성하고, 3D 이미지 분석 소프트웨어 등 하였다. 아밀로이드 베타 1-40에 노출 된 쥐의 뇌 조직 </또는 치료 개입없이 서브&gt; (Aβ 1-40) 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 또는 시험관 내 조건에서의 어느 하나로부터 다른 셀의 3 차원 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다.

이 섹션은 3 차원 형태 계측 분석에 의해 생성 된 정량적 관찰의 예를 나타낸다. 앞서 언급 한 12 개의 모든 매개 변수의 완전한 결과를 위해, 우리의 이전 출판 (10)를 참조하십시오. 질적 관찰 성상은 Aβ 1-40 주입 쥐 (그림 1)에서 긴 보통이었다 얇거나 두꺼운 가지를 나타냈다. 짧은 지사와 함께 몇 가지 작은 별 모양의 성상 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K 조회수.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

비디오: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

연구

신경과학

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

생물학

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...