The authors have nothing to disclose.

본 연구는 의료 과학이란 대학의 윤리위원회 (테헤란,이란)의 승인을 실험실 동물의 관리 및 사용 (NIH)에 대한 설명서에 명시된 정책에 따라 실시 하였다. 1. 동물, 수술 및 시료 준비 참고 : 3D 공 초점 현미경 분석을 위해 뇌 조직을 준비합니다. <ol><li> 두 그룹으로 무작위로 나누기 동물 : Aβ 1-40 -injection (N = 8)과 제니스 타인 처리와 Aβ 1-40 -injection (N = 8); 수술 전 위관 1 시간으로 제니스 타인 (예 : 폴리에 피마 자유 등의 차량에 희석하여 10 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)과 동물을 마취. 발가락을 곤란하게 한 후 철수 반사의 부족으로 적절한 마취를 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 수술 중 눈에 연고를 사용합니다. </li><li> 정위 장치 및 면도 헤드에서 동물을 놓습니다. IOD 적용오프라인 용액 두피 절개 전에 청소 및 감염의 위험을 최소화하기 위해 수술 중 무균 조작 위치를 유지한다. 쥐의 뇌 아틀라스 8 항에있어서, 브레 그마에 -3.5 mm 후방, 중간 선에 ± 2mm 측면 및 경막 아래 -2.8 mm의 해마에서 아밀로이드 베타 1-40 stereotaxically (4 μL)를 주입한다. 정위 방법은 이전의 출판물 (9)를 참조하십시오. </li><li> 동물은 동물의 편안함을 보장하기 위해 완전히 의식 때까지 수술 후 관찰 / 치료를 제공합니다. 복구하는 동안 따뜻한 동물을 유지하고, 완전히 회복 될 때까지 다른 동물 케이지에게 반환하지 않습니다. 수술 후 동물에서 감염의 징후에주의를 기울이십시오. </li><li> 삼주 수술 후 케타민 (150 ㎎ / ㎏)에 의해 깊이 동물을 마취. 0.1 M PBS (PH = 7.4)에서 4 % 파라 포름 알데히드 다음에 0.9 % 식염수 동물을 관류하여 transcardial 고정을 수행 한 후 제거하고 10에 기술 된 바와 같이 &lt;뇌를 해결/ SUP&gt;. </li><li> 4 ℃에서 2-3 일 동안은 4 % 파라 포름 알데히드의 머리를 포스트 - 수정. </li><li> 조직 포함 장비를 이용하여 파라핀 블록에서 조직을 포함, 그것은 올바른 정렬 또는 절편을 방해 할 수 있기 때문에 충전 언더 또는 오버 충전 카세트를 피할 수 있습니다. 파라핀 블록에서 조직의 방향에주의를 기울이십시오. 주 : 래트 해마는, 예를 들어 대뇌 반구의 후방 부에 가깝다. 따라서, 조직이 방법에 포함되어야 뇌의 후방 부에서의 단면 처리가 시작될. 원하는 해부학 적 구조에 도달하는 가이드로 Paxinos 아틀라스 (8)을 사용합니다. </li><li> 공기의 움직임이 어려운 부분의 취급을하기 때문에 멀리 공기 초안 또는 출입구에서 마이크로톰을 놓습니다. </li><li> 이 깊이가 필요한 경우와 마찬가지로 완전한 성상 세포의 Z - 스택 이미지를 생산하기 위해 두께 ≥20 μm의와 섹션을 사용합니다. 그들이 원하지 않는 두께를 가질 수있다로 인해 열 전자에, 처음 몇 섹션을 사용하지 마십시오xpansion. </li><li> (5 ± 2 C, 파라핀의 용융 온도 이하) 단지 충분히 부분을 평평하게 따뜻한 물 표면에 섹션을 놓습니다. 주 : 섹션의 확장 구조의 형태를 교란 할 위에. 신중하게 섹션을 전송하는 작은 붓을 사용합니다. 각 슬라이드에 2-3 섹션을 수집합니다. </li><li> 저장 수직 위치에서 랙에 슬라이드와 몇 시간 또는 O / N 37 ℃에서 그들을 건조 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 면역 조직 화학 <ol><li> Deparaffinize 크실렌 섹션, 2 × 10 분, 알코올 그라데이션을 통해 (99.8 %, 95 %, 70 %, 10 분마다) 및 PBS를 재수. </li><li> 0.25 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.25 % 트리톤 X-100 및 3.5 % 정상 혈청 (4 ℃에서 O / N)를 함유하는 PBS로 1,500 : 글 리아 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)에 대한 항체와 함께 인큐베이션 1 희석. </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 이차 알칼리성 인산 공역 antibodie으로 부화1 시간을위한 S (1 : PBS에 희석 (100), 21 ˚C). </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS의 섹션을 씻으십시오. 참고 : 배경 염색을 최소화하기 위해 이차 항체 후 제대로 부분을 세척하는 것이 중요합니다. </li><li> 액체 영구 레드 발색 (15 ~ 20 분)와 함께 어둠 속에서 섹션을 품어. 참고 : 사용하기 전에 더 이상 30 분 솔루션을 준비합니다. </li><li> 3 × 5 분 동안 PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 마지막으로, 4-6-diamidino -2- 페닐 인돌과 핵 염색 (DAPI를 1 : PBS에 희석 500) 이전에 다루-미끄러 할 수 있습니다. 현미경 전에 냉장고에 24 ~ 48 시간에 슬라이드를 저장합니다. </li></ol> 3. 공 초점 현미경 주 : 정량적 평가 (아래 참조), 오류의 위험을 줄이기 위해 분기 겹치는 최소 명확하게 볼 DAPI로 핵 염색 성상 세포를 선택한다. Z 스택 이미지를 생산하는 것은 시간이 소요됩니다. 환자 수 및 처리하는 동안 중지하지 마십시오. 직립 공 초점 레이저 주사 현미경은 U 인성상 세포에서 3D 이미지를 만들 나오지. <ol><li> 현미경 단계에 슬라이드를 넣고 63X 목표를 선택합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 열고 시작 시스템을 클릭합니다. 찾기 탭을 클릭합니다. 할당로 이동, 적절한 빛을 조정 GFP를 선택합니다. </li><li> 빛을 반영하기 위해 셔터를 엽니 다. 셔터의 오른쪽에있는 반사경 리볼버를 찾아 성상 세포 (녹색, 빨간색이나 보라색)에 의해 반영되어야 색상을 선택; (FSet20의 WF) 붉은 색은 여기에 사용되었다. 참고 : 현미경의 안구에 직접 사진을 집중하는 것을 잊지 마십시오. </li><li> 최적의 초점을 찾으려면, 모든 닫힌 클릭 화면 모드에서 현미경 핀을 넣어 취득 탭을 클릭합니다. </li><li> 인수 탭에서 스마트 설치를 클릭; 창이 열립니다. 목록에서 (현재 프로젝트 즉, DAPI와 알렉사 플 루어 555) 적절한 형광을 선택합니다. 색상이 자동으로 선택됩니다. </li><li> 최고의 신호를 클릭하고 적용을 한 후 설정 노출 클릭; 컴퓨터가 자동으로 노출 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 이미지를 최적화하기 위해, 채널 창으로 이동합니다. 표시 해제 트랙 2는, 트랙 1을 선택하고 라이브를 클릭합니다. 필요한 경우 이미지에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 채널 창에서 다음 키를 조정; 자동으로 핀홀을 최적화 할 수 1AU을 클릭합니다. 그렇지 않으면 공 초점 영상이 최적이 될 것이다이 단계를 수행하는 것이 매우 중요합니다. 최고의 강도를 (추가 소음을 줄이기 위해 800 아래이 설정을 유지)하도록 게인을 조정합니다. 마지막으로, 2와 3 사이의 디지털 게인을 설정합니다. </li><li> 표시 해제 트랙 1은 트랙 2를 클릭하고 트랙 2에 대한 단계 3.8를 반복합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다. </li><li> 획득 모드 창으로 이동합니다. 프레임 크기를 최적화하고 평균하여 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 변경하려면 프레임 크기는 X * Y에 가서 X 1,024 1,024을 선택합니다. 더 나은 이미지를 만들 느린 속도를 선택합니다. </li><li> 평균화로 이동하여 번호를 ≥4 선택합니다. 이 값은 평균 생산은 평균화 될 스캔의 수를 나타낸다획득 한 이미지를 이메일. 이제 스냅 버튼을 클릭하고, 촬영 된 2D 이미지를 저장합니다. </li><li> 3D 영상의 경우, Z-스택 창을 엽니 다 원인이 스마트 설치의 Z-스택 항목을 표시합니다. </li><li> 셀의 깊이, 즉, Z-스택에 대한 첫 번째 및 마지막 위치를 설정한다. 첫 번째 라이브를 클릭합니다. 그런 다음 Z-스택 시작하는 것입니다 조직 성상 세포의 최상 위치에 초점 현미경의 초점 드라이브를 사용합니다. 설정 먼저 클릭합니다. 그리고 Z-스택 검색이 중지해야 조직의 성상 세포의 가장 낮은 위치에 아래로 초점을 맞 춥니 다. 설정 마지막을 클릭합니다. 그런 다음 라이브 중지합니다. </li><li> 간격을 선택; 1.01 μm의 현재 연구에 사용되며, 선택 간격은 슬라이스의 개수를 설정하는 최적 클릭함으로써 이루어질 수있다. </li><li> 시작 실험을 클릭합니다. 스캔이 완료되면 이미지를 저장합니다. 표면적 및 성상 세포 영역의 용적, 전체 성상 세포를 포함 브래지어 :이 이미지는 다음과 같은 파라미터의 측정에 사용한다nches, 세포체 및 핵. </li><li> 단계 3.6에서 3.11 사이에 기술 된 바와 같이 또는 10X 20X 대물 렌즈를 이용하여 2 차원 화상을 취득. 이 이미지는 측정 된 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개수 / 1,000 ㎛의 2)의 강도를 이용할 수있다. </li></ol> 4. 성상 세포 밀도와 GFAP + 형광 강도 <ol><li> 20X 2D 이미지를 엽니 다. 이미지 창 왼쪽에있는 히스 (Hisogram)을 클릭합니다. </li><li> 성상 세포 밀도를 계산하려면, 20X 목표 아래 세 개의 연속 시야를 선택합니다. 필드에 지점을 중복, 최소 명확한 소마을 나타내는 성상 세포의 수를 계산합니다. </li><li> 형광 강도를 정량화하기 위해, 이미지 윈도우의 바닥 글에 적절한 도구 (사각형 또는 원형)을 선택하고, 측정 영역을 선택합니다. 평균값과 표준 편차에 따라 자동으로 표시 이미지 참고. STR 간의 현재 연구에서, 0.7 mm의 직사각형 영역 (2)iatum 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 내측 블레이드를 사용 하였다. </li></ol> 5. 성상 세포 지점 <ol><li> 분기의 길이와 수를 정량화하는, 화상 해석 소프트웨어 (20X으로 얻은) 3D 이미지를 사용한다. 선택한 성상 세포의 각 지점의 길이를 따라 수동으로 선을 그립니다. 그런 다음 라인 길이를 측정하는 전문 측정 툴을 선택합니다. 분기의 수를 정량화하기 위하여, 표시 항목의 수를 카운트하는 카운트 수단을 선택한다. </li></ol> 6. 볼륨 및 표면적 참고 : 3D 이미지 분석 소프트웨어에서 수동으로 구조를 표시 초점과 훈련을 필요로한다. 실험을 시작하기 전에 몇 번 연습. <ol><li> 성상 세포의 핵, 소마, 세포체와 영토의 부피와 표면적을 정량화하기 위해, 같은 Volocity 6.1로 3D 이미지 분석 소프트웨어 (단계 3.1-3.16에 인수) 3D 이미지를 전송합니다. </li><li> 소프트웨어를 열고 새로 만들기도서관. 새 라이브러리에서 왼쪽 회색 컬럼에 모든 이미지를 드래그합니다. 그런 다음, 하나의 3D 이미지를 선택합니다. 오른쪽에, 다른 색상으로 다른 채널이 있습니다. 관심의 한 채널을 켜십시오; 예를 들어 DAPI에 대한 파란색 채널은 핵을 측정 할 때. 최적의 대비를 얻기 위해 수동으로 밝기를 변경합니다. </li><li> [도구] 메뉴를 선택, 볼륨을 확인하고 Z 스택 이미지에서 하나의 3D 이미지를 생성로 이동합니다. 편집 메뉴에서 속성을 클릭하고 X는, Y 및 Z 속성이 제시되어 있는지 확인; 그렇지 않으면 차원 분석을 수행하는 것이 불가능하다. </li><li> 도구 모음에서 자유형 RIO 도구 아이콘을 클릭합니다. 성상 세포 핵의 부피와 표면적을 측정하는 것은 DAPI 표지 된 핵 주위에 선을 그린다. </li><li> 성상 전지 본체의 부피와 표면적을 측정하는 것은 분기 제외한 주위 소마 선을 그린다. </li><li> 전체 성상 세포 (지점 포함 세포체)의 부피와 표면적을 측정하려면 다음 소마 주위에 선을 그립니다모든 지점의 표면. </li><li> 성상 세포 영토의 부피와 표면적을 평가하는 것은 가지의 팁 사이에 선을 그립니다. 참고 : 눌러 원하지 않는 그림을 지울 키보드 삭제합니다. </li><li> 측정 프로토콜을 만들 수있는 이미지 창 상단의 측정 메뉴를 클릭; 다른 도구를 포함하는 창이 열립니다. </li><li> 드래그는 윈도우 (창)의 상단에 개체를 찾을 수 있습니다. , 인구 1로 설명하는 이름을 부여 관련된 색상을 선택하고 측정을 클릭합니다. 또 다른 창이 열립니다. </li><li> 매개 변수 즉, 볼륨 또는 표면 영역을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 데이터는 테이블에 나타납니다. </li><li> 측정 메뉴에서 데이터를 클릭 저장 및 측정 항목 만들기를 선택합니다. </li><li> 열린 창에서 호출 새로운 측정 항목을 선택합니다. 그런 다음 데이터에 이름을 지정하고 확인을 클릭합니다. </li><li> 마지막으로, 그래프 패드로 통계 소프트웨어로 데이터를 내보내거나 프로그램을 엑셀. 데이터를 분석하는 t 테스트를 사용하여 다음 2D GR 플롯aphs. </li></ol>

<ol>
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이 작품은 의료 과학 대학이란 (테헤란,이란)에서 외스 테르 예틀 란드의 지방 협의회, (스웨덴)과 세포 및 분자 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.

현재 프로토콜에서, 우리는 성상 세포의 형태와 관련이 있었다 (12) 다른 매개 변수를 평가하는 3D 공 초점 형태 계측을 고용했다. 이러한 목적을 위하여, Aβ 1-40와 쥐의 해마 조직 - 또는 소염제로서 게니 전처리없이 유도 astrogliosis가 사용되었다. 3D 이미지 및 형태 계측 학적 소프트웨어를 사용하여, 우리는 아스트로 사이트의 형태 즉 astrogliosis에 제니스 타인 효과를 표시 할...

건강한 중추 신경계 (CNS)에서 별아교 세포는 혈류, 에너지 대사, 시냅스 가소성과 기능 및 세포 외 이온의 조절에 중요한 역할을하는 신경 전달 물질 및 1-3 항상성. 또한, 성상 세포는 다른 유해한 자극 및 비대, 증식 및 성상 세포 4,5의 기능 리모델링을 특징으로 반응 astrogliosis을 통해 외상, 감염, 허혈 또는 ​​신경 퇴행과 같은 비정상적인 상태에 응답합니다. 반응성 astrogliosis은 치료 개입의 임상 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 조직에 염증 반응 및 복구 과정을 설계하고있다. 따라서, 성상 교세포는 중추 신경계에 영향을 미치는 질병의 다양한 치료 적 개입에 대 한 잠재적 인 대상으로 지난 수십 년 동안 신경 과학자로부터 주목을 받았다. 성상 세포는 일반적으로 잘-D와 별 모양이소마 6 퍼져 efined 가지. 뇌 질환 상태에서, 성상 세포는 복잡한 분기되고 베타 아밀로이드 (Aβ)의 존재하에, 예를 들면 팽윤 (7) 단부를 나타낸다. 이 문서에서는 공 초점 현미경으로 인수 성상 세포의 3D 이미지를 분석하기위한 프로토콜을 제공합니다. 각 성상 세포에 대한 정량적 십이 다른 파라미터를 측정 하였다 : 표면적 및 성상 세포의 영역 (성상 세포에 의해 덮여 조직), (분기 포함) 전체 셀, 전지 본체, 및 핵의 양; 총 길이와 가지의 수; 성상 검출에 사용되는 항체의 형광 강도; 및 성상 세포의 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2). 이를 위해, 우리는 함께 또는 항 염증 물질로서 게니 처리없이 Aβ 1-40의 주입 intrahippocampal 노출 래트에서 뇌 부분을 사용 하였다. 설명 프로토콜 형태 계측에 사용될 수있다시험 관내 또는 생체 내에서 서로 다른 조건에서 다른 세포 유형의 alysis.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

뇌 신경 교세포 같이, 성상 세포는 중추 신경계에서의 다양한 기능적 역할이있다. 유해 자극의 존재에서, 성상 세포는 기능 및 구조적 특성, 반응 astrogliosis라는 조건을 수정합니다. 여기에, 성상 세포의 형태 학적 특성 평가를위한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 지점 표면적 및 성상 세포 (성상 세포 지역)에 의해 덮여 조직, 지점, 전지 본체와 핵을 포함하는 전체 성상 세포의 부피, 즉 12 가지 파라미터 부량뿐 아니라 전체 길이 및 개수를 포함하는, 강도 성상 검출에 사용되는 항체의 면역 형광 및 성상 세포 밀도 (개 / 1,000 ㎛의 2)의. Volocity 6.3 측정에 사용 된 것처럼이 목적을 위해 3 차원 (3D) 공 촛점 현미경 이미지를 생성하고, 3D 이미지 분석 소프트웨어 등 하였다. 아밀로이드 베타 1-40에 노출 된 쥐의 뇌 조직 </또는 치료 개입없이 서브&gt; (Aβ 1-40) 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 또한 생체 내 또는 시험관 내 조건에서의 어느 하나로부터 다른 셀의 3 차원 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다.

이 섹션은 3 차원 형태 계측 분석에 의해 생성 된 정량적 관찰의 예를 나타낸다. 앞서 언급 한 12 개의 모든 매개 변수의 완전한 결과를 위해, 우리의 이전 출판 (10)를 참조하십시오. 질적 관찰 성상은 Aβ 1-40 주입 쥐 (그림 1)에서 긴 보통이었다 얇거나 두꺼운 가지를 나타냈다. 짧은 지사와 함께 몇 가지 작은 별 모양의 성상 ?...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

망막 섹션 Morphometric 분석

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

연구

신경과학

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

Fungiform 용의자 객관적인 분석을위한 덴버 유두 프로토콜

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

뇌 구조의 3차원 형상 모델링 및 분석

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.