이 프로토콜은 많은 수의 센서와 모터 섬유아세포 및 슈완 세포를 빠르게 획득하는 데 사용될 수 있다. 이 메시지를 통해 얻은 세포는 신경 재생 및 신경계 질환의 연구에 사용될 수 있다. 우리는 데모가 차동 소화 단계의 시간을 더 잘 제어하고 실험 단계를 이해하기 쉽게 하기 위해 실험을 나타낼 수 있음을 보여줍니다.
파열하려면 가위를 사용하여 뒤쪽의 피부에 3 센티미터 절개를합니다. 척추를 제거합니다. 척수를 노출하기 위해 척추 운하를 조심스럽게 엽니다.
60mm 페트리 접시에 척수를 레이스, 얼음 차가운 D 행크스의 3 ~ 4 밀리리터와 해부 현미경에서 소금 용액을 균형, 복부 뿌리와 등쪽 뿌리를 소비. 얼음 차가운 D 행크스 균형 소금 용액에 넣어. HBSS를 제거한 후 신경을 가위로 3~5mm 조각으로 자른다.
0.25%의 트립신 1밀리리터를 넣고 신경 조각을 5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 섭씨 37도에서 18~20분 동안 배양하세요. 다음으로, 소화를 중지하려면 10 %의 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM의 3 ~ 4 밀리리터에 추가하십시오.
혼합물을 약 10번 위아래로 부드럽게 피펫합니다. 5 분 동안 800 배 G에서 원심 분리기. 원심 분리 후 상체를 폐기합니다.
그리고 10%의 FBS로 보충된 DMEM의 2~3밀리리터에서 침전을 다시 중단합니다. 400 메쉬 필터를 통해 셀 서스펜션을 필터링한 다음 서스펜션을 사용하여 60mm 페트리 접시를 접종합니다. 5%의 이산화탄소가 있는 경우, 페트리 요리를 섭씨 37도에서 4~5일 동안 배양합니다.
배양이 90%에 도달하면 1XPBS를 사용하여 세포를 한 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 슈완 세포를 소화하려면 60mm 접시당 섭씨 37도에서 0.25 %의 트립신 1 밀리리터를 추가하십시오. 실온에서 8~10초 후에는 10%의 FBS로 보충된 3밀리리터의 DMEM을 추가하여 소화를 중단합니다.
슈완 세포를 분리하려면 파이펫으로 셀에 부드럽게 불어주세요. 현미경으로 세포가 분리되는지 확인합니다. 그런 다음 백조 세포를 포함하는 배지를 수집하고 원심분리기를 5분 동안 800배 G로 수집합니다.
상체를 버리고 3 밀리리터의 매체로 침전을 다시 중단합니다. 이 서스펜션을 사용하여 코팅되지 않은 60mm 페트리 요리를 접종하고 30~45분 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양합니다. 슈완 세포를 폴리 L 리신 코팅 중형 요리에 포함하고, 2 일 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양 할 매체에 대한 브랜드.
슈완 세포를 함유한 배지를 제거한 후 섬유아세포를 세척하고 1XPBS로 페트리 접시를 준수한다. 섬유아세포를 소화하려면 섭씨 37도에서 0.25%의 트립신 1밀리리터를 추가합니다. 소화를 따라 섭씨 37도에서 2분간 진행한 후, 10%의 FBS로 보충된 DMEM을 추가하여 소화를 종료합니다.
섬유아세포를 분리하려면 파이펫을 사용하여 접시 바닥에 날려 버리십시오. 섬유아세포를 포함한 배지를 수집하고 원심분리관으로 옮기는다. 5 분 동안 800 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 폐기하고 10%의 FBS를 포함하는 DMEM의 2밀리리터로 침전을 다시 중단합니다. 코드되지 않은, 60밀리미터, 페트리 접시에 세포를 접종하고 30~45분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 성장 매체를 제거하고 폐기하여 페트리 접시를 고수할 섬유아세포를 분리합니다.
10%의 FBS로 보충된 DMEM의 밀리리터 3개추가. 통로가 90%에 도달할 때까지 이틀 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 차동 소화와 준수를 반복합니다.
2 일 동안 섬유 아세포와 슈완 세포에 통로를 배양 한 후, 세포를 소화, 그들을 수집, 그들을 계산. ICC 염색을 위해 이러한 세포의 1회 10분의 1의 농도로 PLL 코팅 된 슬라이드를 접종합니다. 베이의 대비 현미경 검사는 격리 과정 전반에 걸쳐 배양 된 슈완 세포와 섬유 아세포의 형태를 보여줍니다.
장기간 배양 시간 후에, 슈완 세포는 섬유아세포 사이또는 섬유아세포의 표면에 함께 군집되었다. 10 초 동안 소화 한 후, 붉은 화살표로 표시된 슈완 세포는 섬유 아세포가 평평하게 유지되고 접시의 바닥에 부착된 동안 둥글게 되었습니다. 차동 소화 및 차동 준수에 의한 격리 후 전형적인 세포 형태학은 모든 4개의 세포 유형에 대해 관찰되었다.
모터 섬유아세포, 감각 섬유아세포, 모터 슈완 세포 및 감각 슈완 세포. 감각및 운동 섬유아세포는 원뿔 초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 섬유아세포는 CD 90 X33342 염료에 대한 항체로 염색되어 세포 핵을 표지하는 데 사용되었다.
섬유아세포 면역염색 및 핵 염색의 병합된 심상은, CD 90및 육각형 공동 표지세포의 92.51%와 92.64%가 각각 모터 및 감각 섬유아세포에 존재한다는 것을 나타냈다. 감각 및 모터 슈완 세포는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 시각화되었다. 슈완 세포는 세포 핵을 표지하는 데 사용되었던 S100 X33342 염료에 대한 항체로 염색하였다.
스완셀 면역염색 및 핵 염색의 병합 이미지는 각각 모터 및 감각 슈완 세포에서 S100 및 헥스 공동 표지 세포의 91.61%와 93.56%의 존재를 나타냈다. 세포 순도또한 유동 세포측정을 사용하여 분석되었다. 섬유아세포 배양에서는, 세포의 대략 90%는 나머지 세포가 Schwann 세포인 동안 FCA 그래프에 있는 M2에 의해 표시된 섬유아세포이었습니다.
슈완 세포 배양에서, 세포의 92% 이상은 슈완 세포였으며, FCA 그래프에서 M2로 다시 나타났으며, 나머지 세포는 섬유아세포였다. 이 프로토콜은 신경 재생을 촉진하기 위해 섬유아세포와 슈완 세포 이식의 센서 및 모터 신경 재생 메커니즘을 시작하는 데 거의 유용하지 않습니다.
