이 프로토콜은 다양한 생체 재료에 대한 숙주 면역 반응을 특성화하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 나중에 더 나은 미래의 의료용 임플란트를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 생체 물질에 침투하는 면역 세포에 대한 정보를 제공하여 세포가 손상 및 물질 이식에 반응하는 메커니즘과 개선된 치료법의 표적을 결정하는 데 도움이 됩니다. 동일한 프로토콜을 수정하여 다양한 환경에서 면역 반응을 특성화할 수 있습니다.
일주일 전에 ECM 임플란트를 받은 쥐의 대퇴사두근을 해부하고 5밀리리터의 무혈청 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브에 모았습니다. 마지막으로 가위를 사용하여 조직을 깍둑썰기했습니다. 다음으로, 5m리터의 소화 효소 배지를 튜브에 넣는다.
소화 배지와 깍둑썰기한 조직이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도, 100RPM에서 45분 동안 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 소화된 조직 현탁액을 70미크론 스트레이너를 통해 개별 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 5밀리리터 주사기 헤드를 사용하여 단단한 조직 덩어리를 으깨고 실온 PBS로 여과기를 세척합니다.
스트레이너에 남아 있는 잔여물을 버리고 실온 PBS에서 튜브의 부피를 50밀리리터로 조정합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 PBS에서 10밀리리터의 차가운 5밀리몰 EDTA 용액에 펠릿을 재현탁시킵니다. 샘플에 혈액 세포가 있는 경우 펠릿을 1밀리리터의 RBC 용해 완충액에 재현탁시키고 10분 동안 배양한 다음 9밀리리터의 EDTA를 추가합니다.
서스펜션을 얼음 위에 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 콜드 PBS로 볼륨을 50밀리리터로 조정합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿과 100마이크로리터의 콜드 PBS를 재현탁시킵니다.
현탁액 10마이크로리터를 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 10마이크로리터의 트립 및 카운팅을 위해 파란색과 혼합합니다. 남은 양의 세포를 V 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 웰에서 20마이크로리터의 세포를 제거하고 새 웰에 추가하여 염색되지 않은 대조군으로 사용합니다.
그런 다음 PBS를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 200마이크로리터로 가져옵니다. 원심분리에 의해 플레이트 웰의 바닥에 있는 세포를 수집하고 웰당 1 내지 1000 농도의 생존도 염료의 100 마이크로리터에 세포를 재현탁시킵니다. 배양이 끝나면 100 마이크로 리터의 신선한 PBS로 각 웰을 세척하고 웰 당 200 마이크로 리터의 염색 완충액에 펠릿을 재현탁시킵니다.
두번째 원심분리 후에, 단핵구 차단제의 1 내지 100 희석액의 50 마이크로리터에 있는 세포를 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 50마이크로리터의 항체 칵테일을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
그런 다음 웰당 100마이크로리터의 염색 완충액으로 웰을 세척합니다. 세포를 다시 원심분리하고 200마이크로리터의 염색 완충액으로 세척합니다. 이 과정을 두 번 더 반복한 후 400마이크로리터의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.
샘플을 분석하기 전에 염색되지 않은 샘플을 실행하여 측면 산란도와 전방 산점도에서 세포 집단을 조정할 수 있습니다. 그런 다음 염색된 샘플을 실행합니다. 자가형광 서명을 추출합니다.
그런 다음 FCS 파일을 가져와서 혼합 해제를 위한 컨트롤로 사용합니다. 혼합 해제 아이콘을 클릭하여 혼합 해제 마법사를 열고 양성 및 음성 모집단을 게이팅하여 모든 단일 색상 컨트롤을 사용하여 혼합 해제를 수행합니다. 그런 다음 QC 섹션을 클릭하고 복잡성 지수를 확인합니다.
복잡성 지수는 스펙트럼 서명이 함께 혼합되지 않을 때 스펙트럼 서명 모음이 얼마나 구별 가능한지를 측정한 것입니다. 마지막으로 live unmix(라이브 혼합 해제)를 클릭하여 샘플을 unmixing합니다. 여기에서, 대조군 마우스 조직에 대한 14가지 색상 사실의 결과를 관찰할 수 있습니다.
이 분석에서는 ly6g 양성 호중구 및 ly6c 중간 및 높은 발현 단핵구 클래스와 같은 여러 로비스트 집단을 관찰할 수 있었습니다. CD11c 높은 MHC 두 개의 양성 수지상 세포는 대식세포와 호중구 및 단핵구와 같은 다른 골수성 계통 세포를 배제하기 위해 CD11b에 대해 게이트링되었을 때 쉽게 분명했습니다. CD206 양성 CD86 양성 수지상 세포의 하위 집합은 수지상 세포와 같은 CD86 높은 M1과 수지상 세포 집단과 같은 CD206 높은 M2를 모두 포함하는 이 CD11c 양성 집단에 초점을 맞춰 식별할 수 있습니다.
F4/80은 다양한 대식세포 집단에서 흔히 관찰되는 발현 구배를 보여주었습니다. Siglec-F는 F4-80 양성 및 음성 집단 모두에 존재했으며, 각각 대식세포 하위 집합과 호산구에 해당할 가능성이 가장 높습니다. 세포 표면 마커로 염색하면 세포 유형을 이러한 지정이 가능하지만, 다른 마커를 발현하는 세포는 보다 이분법적인 분류가 아닌 기능적인 방식으로 관찰해야 한다는 점에 유의해야 합니다.
이 프로토콜을 시도할 때, 패널을 설계하기 전에 언더스테인딩된 샘플의 자가형광 특성을 이해하는 것이 더 나은 혼합을 달성하는 데 중요하다는 점을 명심하십시오. 세포 분석 외에도 세포 분석을 통한 다운스트림 평가, in vitro, transcriptomic 분석 또는 세포 형태를 평가하기 위한 현미경 분석을 위해 분리된 세포를 특정 집단으로 분류할 수 있습니다. 생체 재료의 유세포 분석의 복잡성이 증가함에 따라 기초 면역학 연구와 새로운 치료제 엔지니어링 간의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다.
