이 방법은 백혈구 사이의 통신이 분자 및 세포 수준에서 발생하는 방법과 같은 인간 면역 학적 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 무정제 인간 T 세포가 비교적 짧은 기간 동안 ex vivo를 분석할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 헤닝 Kirchgessner 될 것입니다.
50 밀리리터 원뿔관에 30 밀리리터의 ACK 용해 완충제와 갓 뽑은 인간 말초 혈액 1밀리리터를 혼합하여 시작합니다. 실온에서 8분 후, 원심 분리 세척을 위해 PBS로 튜브를 채우고 37°C에서 60분 동안 배양 배지 2밀리리터로 펠릿을 재보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 500마이크로리터의 개별 FACS 튜브에 배양 배지의 500마이크로리터에 제5차 황색포도상구균 B 또는 SEB 장전 또는 언로드 라지 세포에 5회 10번 추가한 다음, 650마이크로리터의 팬백세포를 첨가한다.
공동 배양을 회전시키고, 37섭씨에서 45분 간 잠복할 수 있도록 신선한 배양 배지의 150마이크로리터에서 펠릿을 재보선한다. 그런 다음 100 rpm에서 10 초 동안 세포를 부드럽게 소용돌이치면서 1.5 % 파라 포름알데히드의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 후, 1 %BSA로 보충 된 PBS의 1 밀리리터로 고정을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다.
PBS 플러스 BSA 및 0.1% 사포닌의 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 96-well, U-바닥 플레이트의 두 개의 개별 우물에 세포 샘플을 추가합니다. 실온에서 15분 후, 플레이트를 원심분리하고 PBS 의 50 마이크로리터에 펠릿을 재분배하고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 용해된 형광구 공주 항체 또는 화합물을 포함하는 BSA 및 사포닌의 마이크로리터로 펠릿을 재연한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 BSA 및 사포닌의 150 마이크로리터에서 세포를 세 번 세척하고 PBS의 60 마이크로리터에서 펠릿을 재보종합니다.
흐름 세포측정에 의해 셀을 이미지하려면 분석 소프트웨어를 열고 액체 수준을 확인하고 악기 메뉴에서 시작을 클릭합니다. 다음으로 로드를 클릭하고 메시지가 표시되면 샘플을 포트에 로드합니다. 조명 탭에서, 적절한 나노 미터 길이에 여기 레이저 전력을 변경합니다.
그런 다음 채널 4및 11의 게이트를 조정하고 채널 1의 영역을 조정합니다. 게이팅 및 레이저 전원 조정을 평가하려면 View 메뉴를 각 게이트로 전환하고 셀과 셀 커플이 표시될 때까지 게이트 및 레이저 전원을 조정합니다. 그런 다음 파일 수집 탭에서 수집할 샘플 이름과 이미지 수와 CD3 염색에 적합한 게이트를 정의하고 인수를 클릭하여 인수를 시작합니다.
획득한 셀 이미지를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어를 엽니다. 보상 드롭다운의 지침에 따라 보정 행렬을 생성하고 매트릭스를 컴포지션 날짜 ctm로 저장합니다. 다음으로 샘플 원시 이미지 파일을 열고 창에 컴프 날짜 ctm을 적용하여 보정된 이미지 및 기본 데이터 분석 파일을 생성합니다.
보정된 이미지 파일을 연 후 이미지를 색상 모드로 변환합니다. 조회 테이블을 조정하여 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 가시 색상을 가져옵니다. 분석 메뉴에서 마스크 관리자를 열고 채널 5용 60%임계값 마스크를 선택하고 마스크를 채우고 T 셀 마스크를 작성하여 T 셀 셀을 정의합니다.
다음으로, 밸리 마스크를 만들기 위해 3 픽셀의 폭으로 채널 2에 대한 밸리 마스크를 선택하고 T 셀과 밸리 마스크를 결합하여 T 셀 시냅스 마스크를 만듭니다. T 셀에서 총 CD3 식을 계산하려면 피처 관리자를 열고 피쳐 강도, T 셀, 채널 5를 만듭니다. T 셀에서 F-actin의 총 양을 계산하려면 피쳐 강도, T 셀, 채널 6을 만듭니다.
면역 시냅스에서 CD3 양을 평가하려면 피쳐 강도, T 셀 시냅스, 채널 5를 만듭니다. 면역 시냅스에서 F-actin의 양을 결정하려면, 기능 강도, T 세포 시냅스, 채널 6을 만듭니다. 마지막으로, F-actin 및 CD3 농축을 정의하기 위해, 면역 시냅스에서 F-액틴 또는 CD3의 비율과 선택된 단백질의 총 발현을 각각 계산한다.
이들 그래프에서, 대리 항원 제시 세포, 또는 AFC 사이의 면역 시냅스에서 단백질 농축을 정량화하기 위한 중요한 게이팅 전략의 개요, 그리고 낮은 부피 인간 혈액 샘플에서 채취한 무정제 범류세포에서 T 세포가 나타난다. 여기서, T세포-APC의 대표적인 이미지는 SEB의 부재 시내에 있는 CD3 및 F-actin의 낮은 수준을 가진 공자, 이러한 T세포-APC 컨쥬게이트는 SEB의 존재에 강한 CD3 및 F-actin 농축을 보여줍니다. 초항제의 부재에서, T 세포의 15%는 면역 시냅스에서 CD3와 F-actin 의 농축을 나타내고, 반면 29%의 농축은 초안티겐의 존재에서 관찰된다.
실제로, 초항제가 없는 경우, 세포내 총 F-actin의 20% 미만이 면역 시냅스에서 축적되고, 초대형항성원이 있는 시냅스에서 30% 이상이 관찰된다. 특히, CD3는 초항제가 없는 경우에도 면역 시냅스에서 축적되지만, 이러한 축적은 또한 수퍼안티겐의 첨가에 의해 현저하게 증가하지만, T세포-APC 면역 시냅스에서 단백질 축적을 정량화하는 이 방법의 적합성을 입증한다. 일단 마스터되면 제대로 수행하면 6~7시간 안에 이 기술을 완료할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 단백질 농축은 또한 SEB없이 APC를 사용하는 경우에 생깁니다, 초항제없이 견본을 포함하여 모든 관련 대조를 포함하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 초해상도 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 면역 시냅스의 미세 한 구조에 대한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 기본적인 연구, 임상 시험 및 번역 과학을 위한 인간에 있는 면역 시냅스를 탐구하기 위하여 세포 통신의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
이 비디오를 본 후, 당신은 인간 T 세포 ex vivo에서 T 세포-APC 결합 영역 및 면역 시 냅 스를 분석 하는 방법의 좋은 이해 해야. 1차 인간 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 장갑을 착용하거나 생물 안전 수준 하에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
