단백질 발현, 정제 및 결정화 실험은 오크 리지 국립 연구소의 미국 에너지 생물 및 환경 연구 사용자 시설인 구조 분자 생물학 센터(CSMB)에서 수행되었습니다. 중성자 회절 데이터는 미국 에너지부 기초에너지과학부 과학사용자시설부(ORNL)의 스Pallation 중성자 출처(SNS)에서 BL-11B MaNDi에서 수집되었습니다. 저자는 데이터 감소에 대한 도움을 브렌던 설리반 감사합니다. X선 회절 데이터는 노스캐롤라이나 주에서 지원하는 노스캐롤라이나 주립 대학의 분자 교육, 기술 및 연구 혁신 센터(METRIC) 시설에서 수집되었습니다. GCS는 ORNL에서 국립 연구 재단 (NRF), 남아프리카 공화국 및 대학원 기회 (GO!) 프로그램에서 부분적으로 지원을 인정합니다. FM은 USDA NIFA 해치 211001 지원을 인정합니다.

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중성자 단백질 결정학은 단백질에서 프로토네이션 상태와 물 분자 방향을 조사하는 매우 민감한 기술입니다. 이 정보는 프로토네이션과 수소 결합 상호 작용의 변화가 종종 효소 화학10의 중심이기 때문에 단백질 촉매 메커니즘에 빛을 비추는 경우가 많습니다. 중성자 단백질 결정학은 유익한 기술이기는 하지만 중성자 회절 실험을 수행하기 전에 고려해야 할 여러 가지 요인이 있습니다.
<ol><li>데이터 수집을 위한 대형 단백질 결정의 요구 사항입니다.</li>
	<li>수소 및 금속 이온과 같은 기타 원소의 산란 특성.</li>
	<li>단정된 샘플로 작업할 때 구조 개선 및 모델 구축 소프트웨어의 제한사항입니다.</li>
</ol>중성자 단백질 결정학은 플럭스 한정 기술이다. X선 회절 데이터 집합과 는 달리, R-팩터가 높고 완전도가 낮으며, 중복성 및 신호 대 잡음 비율은 고유한 제한(플럭스 제한, 준 라우, 긴 파장)으로 인해 중성자 데이터 집합에 대해 예상됩니다. 단일 프레임의 데이터 수집은 일반적으로 12 - 18 시간입니다. 실험의 성공은 샘플 크기와 품질에 크게 좌우되며, 크리스탈은 0.1 mm3의 경우가 종종 최소 요구 사항3입니다. 중성자 회절은 10에서 800 μL에 이르는 결정화 방울을 설정하기 위해 다량의 단백질생산을 요구합니다. 충분히 큰 결정을 성장하기위한 최소 부피는 결정 및 샘플 매개 변수 (https://neutrons.ornl.gov/imagine)를 감안할 때 볼륨 계산기를 사용하여 추정 될 수있다. 큰 결정의 성장은 가장 널리 증기 확산에 의해 달성되었다3. 매달려 있는 낙하 결정화는 10-25 μL에 이르는 큰 방울에서 결정의 성장을 허용하며, 최대 ~ 50 μL에 이르는 더 큰 방울은 시판 가능한 착하 장비14,54를 사용하여 설정할 수 있습니다. 실리콘 9웰 유리 플레이트는 최대 800μL의 부피를 사용하여 매우 큰 방울을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 유리 판은 햄프턴 연구에서 시판되는 "샌드위치 상자"에 배치됩니다. 추가 결정화 기술은 배용기에 의해 낙하 크기의 한계가 결정되는 배치 결정화를 포함한다. 배치 결정화 실험은 마이크로리터에서 밀리리터55까지 다양할 수 있습니다. 결정화는 또한 단백질이 투석막을 통해 침전제와 평형되는 투석 기술을 사용하거나 침전성 농도 그라데이션을 따라 또는 아가로오스56,57과 같은 다공성 플러그를 통해 역확산에 의해 수행될 수 있다. 시드는 원하는 부피의 결정을 얻기 위한 또 다른 대안을 제공합니다. 마이크로 및 매크로 시드는 NcLPMO9D45의 큰 크리스탈을 포함하여 큰 결정 성장을 위해 성공적으로 채택되었습니다. 용해도에 대한 온도의 영향을 포함하여 단백질 상 다이어그램에 대한 일부 지식은 큰 결정 성장에 도움이 됩니다.
중성자 회절 실험을 계획할 때, 회절 데이터 수집 시 신호 대 잡음 비율을 최대화하기 위한 단백질 제제의 최적화가 필수적이다7. H 원자에 의한 밀도 취소및 높은 일관성 있는 산란을 우회하기 위해, 중성자 SLD 지도는 양극성 산란 길이와 낮은 일관성 산란 길이를 가진 동위원소 D에 H 원자를 교환하여 개선될 수 있습니다. 이를 달성하기 위해, 중수소 결정화 완충제에 대한 수소단백질 결정의 증기교환이 수행된다. 이를 통해 용매 분자와 비열성, 틸트라테이블 단백질 H 원자23의 H/D 교환을 보장합니다. 증기 교환은 D2O 기반의 결정화 버퍼 "플러그"를 사용하여 석영 모세관에 수소화 결정을 장착하여 수행되며 가장 자주 적용되는 효과적이고 부드러운 기술을 나타냅니다14,23,35. 교환은 몇 주가 걸릴 수 있으며 바람직하게는 최대 H/D 교환을 보장하기 위해 중음 버퍼를 자주 변경해야합니다. H/D 교환은 또한 결정화 된 버퍼에 직접 침전시킴으로써 수행 될 수있다. D2O 노출로 인한 응력 하에 결정을 두지 않으려면 D2O:H2O 비율을 점진적으로 증가시킴으로써 침을 흡수 공정을 점진적으로 수행해야 합니다58. 이 외에도, 수소화 단백질의 결정화는 또한 음순 H 사이트에서 H/D 교환을 위한 유정완에서 수행될 수 있다22,59. 그러나 D2O 기반 완충은 알려진 H2O 기반 조건3,59의 추가 조정을 요구하는 단백질 용해도에 영향을 미친다는 점에 유의해야 한다. D2O 기반 버퍼는 또한 어떤 경우에는 더 작은 결정으로 이끌어 내는 관찰되었습니다59. 정족성 및 탄소바운드 H 원자를 D로 완전히 교환하면 유족 매체에서 단백질을 발현하여 정해각된 시료20을 생성함으로써 달성될 수 있다. 결과 중성자 SLD 맵은 감전된 시료의 크게 향상되고, 더 이상 수소화시 샘플의 밀도 취소를 표시하지 않는다. 이것은 단백질 또는 공동 인자에 있는 교환할 수 없는 사이트에 H/D 바인딩을 특성화할 때 유익합니다. 그러나, 변성 단백질의 발현은 비용이 높고 수율60이 낮다. 오크 리지 국립 연구소 (ORNL) 구조 분자 생물학 센터 (CSMB) perdeuterated 샘플을 생성 하고자 하는 사용자를 위한 중성 시설 (https://www.ornl.gov/facility/csmb). 전형화된 발현은 전형적으로 정제된 단백질61의 50 mg을 산출하는 1 L 스케일에 대한 생물 반응기에서 수행됩니다.
중성자 회절 데이터의 수집에 따라 개선 및 대화형 모델 구성이 수행됩니다. 페닉스.refine, nCNS 또는 SHELXL28,31,32,33을 포함한 여러 소프트웨어 제품군을 사용하여 개선이 실행될 수 있습니다. Phenix 제품군은 중성자 SLD maps34에서 모델을 수동으로 빌드하는 데 사용되는 Coot와 함께 중성자 회절 데이터를 구체화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 소프트웨어입니다. Phenix와 Coot 모두 중성자 회절 데이터의 처리를 허용하지만 중성자 데이터 및 증식 샘플과 관련된 특이성을 처리하는 데 필요한 특정 기능이 부족할 수 있습니다. 예를 들어, Coot는 "실제 공간 정제"기능은 "폭발"잔류물 (보충 도 26)62결과 때문에 모델 빌드 중에 합병증으로 이어질 수있는 미결 잔류물에 대한 기하학적 최적화를 포함하지 않습니다. 이 문제는 모든 증단된 잔류물에 대한 구속 파일을 생성하여 해결할 수 있습니다. 그러나 이것은 집중적인 프로세스이며 이러한 라이브러리는 현재 공개적으로 사용할 수 없습니다. Phenix에서 세련미를 수행할 때 교환 가능한 H/D 사이트는 처음에는 H 및 D의 0.50 점유율로 설정됩니다. 정교함이 수행됨에 따라 H와 D의 점유율은 중성자 SLD 맵에 따라 개선됩니다. 대화형 모델 구축 중에 차이 밀도 Fo-Fc 맵은 H/D 점유율을 평가하는 데 매우 유익합니다. 지도는 높은 D 점유율을 가진 사이트를 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 이는 프로토 네이션 상태가 촉매 적으로 관련되는 활성 사이트에서 특히 유익하다63. 그러나 H:D가 모호한 상황이 발생합니다. 점유율은 0.70:0.30에 가까우며 중성자 SLD 맵64에서 완전한 신호 가취소됩니다. 또한 준 라우에 중성자 데이터 세트는 종종 약 80 %의 완전성을 가지고 있다는 것을 고려해야하며, 이는 X 선 회절 데이터에 대해 일상적으로 관찰 된 ≥ 98 %보다 낮습니다. Phenix에서 중성자 회절 데이터를 정제할 때 누락된 관찰된 진폭(Fo)은 모델에서 계산되어 반사 목록을 완료하여 모델 바이어스를 도입합니다. 이러한 잠재적 편향 "no_fill" 맵을 고려하려면 대화형 모델 빌드 중에 "채워진" 맵이 아닌 검사해야 합니다.
사용자는 구조의 조인트 X 선/중성자 데이터 구체화 또는 중성자 데이터만 구체화하도록 선택할 수 있습니다. 특히 낮은 해상도의 중성자 SLD 맵을 시각화하는 것은 H/D 증기 교환에도 불구하고 교환할 수 없는 사이트에 H가 여전히 존재하는 수소 단백질에 대해 특히 당황스러울 수 있습니다. 이로 인해 중성자 밀도 맵이 취소되어 불연속 맵65,66의 인상을 줍니다. 해당 X선 데이터 집합을 수집하는 것은 공동 개선에서 이러한 취소를 유리하게 보완합니다(그림 13A 및 도 13B). 관절 정제 전략은 일반적으로 X 선 데이터에 대한 단백질 백본 좌표를 정제하는 것을 포함하며 중성자 회절 데이터는 교환 가능한 사이트에서 H/D 원자의 위치와 점유율을 구체화하는 데 사용됩니다28. 교환 가능한 사이트에 조인트 H/D 점유율을 도입하면 구체화되는 매개 변수의 수가 증가하므로 X선 데이터와의 관절 개선도 데이터 대 매개 변수 비율을 증가시킵니다. 조인트 정제는 동일한 결정 또는 동일한 조건하에서 자라는 결정에서 동일한 온도로 수집되는 해당 X선 데이터 집합을 필요로 합니다. 실온(300K)에서 수집된 중성자 회절 데이터의 경우, 해당 X선 데이터 세트는 방사선 손상을 제한하기 위해 저용량 데이터 수집 전략을 사용하여 실온에서 수집되어야 합니다. 반면, Perdeuterated 샘플은 H/D 신호 취소의 동일한 크기를 가지고 있지 않기 때문에 개선되고 연속적인 중성자 SLD 맵을 제공합니다. 그러나, 금속과 황을 포함한 특정 원소의 중성자 산란 길이는 단백질이 멸폐된 경우에도 중성자 SLD 맵에서 제대로 보이지 않게 만든다(도 13C-F)18. 금속을 특성화해야 하는 경우, 관절 미세 조정에서 X선 회절을 활용하거나 회절 실험을 보완하기 위해 분광 기술을 적용하는 것이 가장 좋습니다. 중성자 전용 데이터 정제는 중성자 데이터 세트가 고해상도를 가지고 있거나 perdeuterated 단백질을 사용할 때 종종 수행됩니다. 또한, 중성자 전용 데이터 정제는 방사선 손상에 매우 민감한 단백질이 연구되고 있는 경우 특히 유용하며, X선 유래 구조는 방사선 유발 유물을 보유할 수 있기 때문입니다. 중성자 데이터 전용 구체화를 수행하려면 해당 중성자 데이터 집합에 충분한 완전성과 해상도가 있는지 확인해야 합니다.
ORNL은 중성자 회절 데이터 수집을 위한 두 가지 시설을 제공합니다: HFIR의 IMAGINE 빔라인과 SNS36,67의 MaNDi 빔라인. 두 계측기 모두 유사한 원리를 사용하는 중성자 회절 데이터 집합을 수집하는 효과적인 수단을 제공하지만, 각 계측기는 빔 시간을 신청할 때 고려해야 할 고유한 사양을 가지고 있습니다. IMAGINE은 준 Laue 데이터를 수집하고 최대 ~ 100 Å의 단위 셀로 결정의 실온 데이터 수집에 최적화되어 있습니다. MaNDi는 최대 ~ 300 Å의 단위 셀이있는 결정에 TOF-Laue 컬렉션을 사용하는 실온 및 극저온 데이터의 수집에 사용할 수 있습니다. 완전한 데이터 집합을 수집하기 전에, 결정이 단일 프레임에 대한 중성자 빔에 노출되는 얻어진 회절 패턴의 품질을 평가하기 위해 크리스탈에서 시험이 수행됩니다. 결정이 충분한 품질인 경우, X선 데이터 처리와 유사한 공정에서 전체 중성자 회절 데이터 집합을 수집, 인덱싱, 통합, 스케일링 및 병합합니다. IMAGINE은 라우에겐과 Lscale 및 MaNDi를 사용하여 맨티드 패키지를 사용하고 3차원 프로파일 피팅48,50,51,68,69,70을 사용합니다. 이러한 시설 중 하나에서 사용자가 되는 과학자는 추가 분석을 위해 MTZ 또는 HKL 형식으로 데이터 집합을 제공합니다.
중성자 회절은 생물학적 거대 분자의 대영 상태 및 수소 결합 상호 작용을 조사하기위한 비 파괴적이고 매우 민감한 기술입니다. 그것은 특히 사진에 민감한 단백질과 금속 단백질에 대 한 유용. 실험을 수행하기 전에 기술및 데이터 처리에 관한 몇 가지 고려 사항을 고려해야하지만, 결과는 관심있는 단백질의 촉매 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 줄 수있는 결과를 산출합니다. 중성자 단백질 결정예학은 전산, 구조, 생화학 및 분광 연구를 보완하여 생물학적 거대 분자를 특성화하는 데 사용되는 생물학자의 도구 상자에서 귀중한 도구입니다.

중성자 대분자 결정학은 단백질의 구조와 근본적인 화학에 독특한 창을 제공하는 기술입니다. 개념적으로 X선 회절과 유사하게 중성자 회절은 거세 분자 구조의 원자학적 세부 사항을 제공하지만, 중성자와 핵의 상호 작용은 종종 X 선 회절로 감지하기 어려운 빛 원자의 국소화를 가능하게합니다. X선 회절 동안 X선은 전자 구름에서 흩어져 있어 수소(H)와 같은 가벼운 원자가 서브-Ångström 해상도2 근처에 없는 전자 밀도 맵에서 제대로 보이지 않게 됩니다. 대조적으로, 중성자의 산란 강도는 다른 산란 길이를 표시하는 동일한 요소의 동위원소와 핵과의 복잡한 상호 작용에 따라 달라집니다. 따라서, 수소(1H) 및 중수소(2H 또는 D)와 같은 가벼운 원자와 동위원소는 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵에서 중추 탄소, 질소 및 산소 원자에 대한 유사한 가시성을 갖습니다. 더욱이, 중성자 산란의 크기는 전자의 수와 무관하기 때문에, 광원으로부터 산란하는 것은 X선 산란에서 관찰되는 바와 같이, 서로 가까이에 있을 때 무거운 원소에 의해 가려지지 않는다. 중성자 회절을 사용할 때 H와 동위원소 D의 향상된 가시성은 촉매적으로 중요한 잔류물, 공동 요소 및 리간드의 프로토네이션 상태에 대한 귀중한 정보를 제공하고 물 분자의 방향을 돕고 촉매 메커니즘 및 단백질 화학에 대한 중요한 정보를 드러냅니다3. 중성자 회절은 또한 비파괴 적 기술인 이점을 제공하며, 특히 금속 센터 또는 감광성 Redox cofactors2를 가진 단백질과 같은 이온화에 민감한 생물학적 샘플에 특히 적합하다는 이점을 제공합니다. 이 문서의 주요 초점은 고품질 중성자 단백질 결정 구조를 얻기 위해 워크플로우에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 우리는 중성자 단백질 회절및 Ashkar 등 al.7의 훌륭한 개요를 위해 Podjarny 외.4, 블레이클리 5, 블레이클리 외.6 및 O'Dell 외.3에 관심있는 독자를 참조합니다.
중성자는 주로 원자로 원천의 핵 분열 또는 가속기 기반 소스8의 접합이라는 두 가지 공정 중 하나를 사용하는 핵 반응 중에 생성됩니다. 원자로 공급원은 235U 동위원소의 핵핵을 채택하여 연속 중성자 빔을 제공하며, 스환화 중성자 소스는 대상, 예를 들어 수은과 같은 액체 금속, 양성자9를 통해 표적을 포격하여 펄스 중성자 빔을 생성한다. 테네시 주 오크 리지에 있는 오크 리지 국립 연구소(ORNL)는 하이 플럭스 동위원소 원자로(HFIR)와 60Hz 펄스 소스에서 안정된 상태 중성자 소스를 모두 보유하고 있습니다(SNS). HFIR에 위치한 IMAGINE 빔라인은 생물학적 거대 분자에 최적화된 중성자 디프라토계(보충 도 1)10입니다. IMAGINE은 중성자 이미지 플레이트 검출기를 사용하여 단위 셀 가장자리가 있는 단일 결정에서 2.8 - 4.5 Å 범위의 좁은 밴드패스를 사용하여 준 라우 데이터를 측정합니다 <150 Å. SNS에 위치한 거대 분자 중성자 디프라토미터(MaNDi)는 구형 검출기 어레이 프레임(DAF)(보충 도 2)11을 장착한 비행 시간(TOF) 라우중성자 디프라토계이다. MaNDi는 2.0 ~ 6.0 Å12 사이의 튜닝 가능한 2 Å 파장 대역폭을 사용하여 10 - 300 Å 범위의 단위 셀 가장자리가있는 단일 결정의 데이터를 측정합니다.
중성자를 생성하는 과정은 에너지 집약성이 높으며, 싱크로트론 소스13에서 X선 빔 플럭스와 대조될 때 상대적으로 약한 중성자 빔 플럭스를 생성합니다. 데이터 수집 중에 충분한 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 적절한 크기와 품질의 결정을 키워야 합니다14. 일반적으로 0.1 mm3의 부피가 > 있는 결정은 적절한 통계15로 데이터를 수집하는 데 필요합니다. 낮은 유동성 이외에, 중성자와 시료 핵 사이의 상호 작용의 고유 한 특성을 고려해야합니다16. 중성자의 산란 길이는 동일한 요소의 동위원소에 대해 다르며, 작은 각도 중성자 산란(SANS)에서 유리하게 활용될 수 있는 특성으로 시료의 영역을 마스크하거나 강조하여 대조 매칭17로 알려져 있다. 회절 실험에서, 음의 일관된 중성자 산란 길이 H(-3.741 fm for 1H)는 탄소(6.6511 fm), 질소(14N 산소용 9.37fm), 질소(9.37 fm) 등 생물학적으로 관련된 원자의 일관된 중성자 산란 길이 이후 중성자 산란 밀도 맵 기능의 취소로 이어질 수 있다. 인(31P용 5.13 fm)과 유황(32S용 2.804 fm)은 양성(표 1)12,14이다. 또한 H(25.274 fm)의 큰 분산 길이는 데이터 수집 중 배경을 증가시켜 데이터 집합의 품질을 저해하고 데이터 해상도7을 손상시킵니다. H에 의해 도입 된 이러한 한계를 회피하기 위해, 중성자 회절에 대한 H를 교환할 필요가, 2H (D), 이는 긍정적 인 일관된 중성자 산란 길이 (6.671 fm) 상당히 낮은 일관성 산란 길이 (4.04 fm)19. 이는 H 사이트20에서 D의 완전한 통합을 보장하는 완전히 유족 매체에서 자란 유기체에 의해 단백질이 발현되는 과정인 감쇠에 의해 달성될 수 있다20. 또한 교환 가능한 부위(titratable groups)에서만 H를 D로 교체하여 단백질을 부분적으로 중음화할 수 있으며, 교환가능한 탄소바운드 부위는 수소화21을 유지한다. 이것은 중음 어머니에게 수소화한 단백질 결정의 성장에 의해 달성될 수 있습니다22. 그러나 가장 일반적으로, 수소화 단백질의 H/D 교환은 H2O 기반 완충23에서 적당하게 큰 결정의 성장에 따라 증기 교환에 의해 수행된다. 이러한 경우, 결정은 석영 모세관에 장착되고 D20 기반의 어머니 술과 함께 증기로 평형화됩니다.
중성자 소스의 제한된 중성자 플럭스는 며칠에서 몇 주에 이르기까지 더 긴 데이터 수집 시간을 초래합니다24. ORNL에서는 IMAGINE과 MaNDi모두 2-6 Å 범위에서 좁은 파장 밴드패스를 사용하여 데이터 수집25를 최적화합니다. 데이터는 실온 또는 극저온에서 수집할 수 있습니다. Cryo 데이터 수집은 잠재적으로 데이터 품질을 개선하고 동결 트래핑 촉매 중간체의 가능성을 열어줍니다. 중성자 회절 데이터 수집에 이어, X선 데이터 세트는 전형적으로 동일한 온도또는 동일한 조건에서 재배된 결정에서 동일한 결정으로 수집됩니다26. 동일한 온도에서의 데이터 수집을 통해 X선 및 중성자 데이터 모두에 대해 구조 개선이 수행될 수 있으므로 물의 가시성 및 위치 변경 또는 대체 적합성을 가진 잔류물의 점유 와 같은 잠재적인 온도 유발 유물을 방지할 수 있습니다27. 조인트 X-ray 중성자 데이터 정제는 데이터 대 파라미터 비율을 증가시키고 단백질 백본 좌표를 X선 데이터에 대해 정제할 수 있도록 하는 이점을 제공하며, 중성자 회절 데이터는 H/D 원자28의 위치를 구체화하는 데 사용된다. 이것은 단백질에 교환할 수 없는 사이트에 H 원자로 인한 밀도 취소가 존재하는 부분적으로 유족 시료를 사용할 때 특히 유용합니다. 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 중성자 구조의 수를 훨씬 초과하지만, X선 데이터의 정제를 위해 처음 설계된 소프트웨어 패키지는 중성자 데이터를 포괄하도록 확장되었습니다3,29,30. 데이터 수집에 따라 페닉스.refine, CNSsolve(nCNS) 또는 SHELXL28,31,32,33과 같은 정제 패키지를 사용하여 모델을 구체화할 수 있습니다. 정제 과정에서 중성자 산란 밀도 맵은 COOT34를 사용하여 수동 피팅을 위해 시각화할 수 있습니다. 구조 솔루션에 따라 좌표 및 중성자 및/또는 X선 회절 데이터 파일을 PDB에 제출할 수 있으며, PDB는 모델을 검증하고 입금하여 공용 access18,29,30에 사용할 수 있습니다.
단백질의 구조적 분석은 수많은 기술이 그들의 기능 및 기계장치를 조사하는 데 사용되는 다각적인 접근 방식입니다35. 중성자 단백질 결정학은 X 선 회절, 분광법, 핵 자기 공명 (NMR) 또는 마이크로 결정 전자 회절 (microED)36과 같은 추가 연구에서 결과를 확장하고 보완하기 위해 귀중한 화학 적 통찰력을 제공합니다. H 원자가 화학의 중심이기 때문에 중성자 단백질 회절은 효소 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 위해 독특하게 배치됩니다. 중성자에 의해 유도된 방사선 손상의 부재는 그(것)들에게 금속로단백질37의 연구 결과에 예외적으로 적합한 프로브를 만듭니다. 여기서는 시료 제제에서 데이터 수집, 정제 및 분석에 이르기까지 중성자 단백질 회절 과정의 대표적인 예를 제시한다(도 1). 중성자 회절 실험을 위한 충분한 크기의 결정은 금속 단백질 Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D)의 성장되었습니다. 노스캐롤라이나 LPMO9D는 글리코시딕 본드38,39에서 산소 원자 삽입에 의한 재발성 셀룰로오스의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질이다. NcLPMO9D 활성 부위에는 N단 히스티딘과 제2 보존 히스티딘(보충 도 3)40으로 구성된 특징적인 "히스티딘 브레이스"내에 단핵 구리 센터가 포함되어 있습니다. 곰팡이 LPMOs의 N 단말은 메틸화되지만 효모에서 재조합 식 중에 전환 후 수정이 발생하지 않습니다. NcLPMO9D 휴게 상태에서 구리 센터는 Cu2+ 산화 상태로 존재하며 단일 전자 감소에 의해 Cu1+로 활성화되어 분자 산소가 결합되어 슈퍼옥사이드 종41,42로 빠르게 감소하여 활성화될 수 있습니다. 전반적인 NcLPMO9D 반응은 하이드록실화 다당류 생성물43을 형성하기 위해 전자 1개와 양성자 2개를 추가해야 한다. 다당류 기판으로부터 수소 원자 추상화(HAA)를 담당하는 활성 산소 종의 정체가 확인되지 않았으며 집중적인 구조 및 계산 연구가 현재 진행 중이다44,45. NcLPMO9D 활성 부위의 레독스 화학을 감안할 때, 방사선 손상의 완화는 특히 관련이 있습니다. NcLPMO9D 결정에 대한 실온 및 극저온 데이터 수집을 여기서 설명하여 휴식 상태 및 활성화된 감소 형태로 NcLPMO9D 구조를 결정한다46. 단백질 결정 마운팅, 데이터 수집을 위한 빔라인 계측기 설치, 데이터 준비 및 좌표 파일 및 모든 원자 중성자 구조를 모델링하는 데 필요한 미세 조정 단계에 중점을 둡니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length</td>
			<td>DiaDent/DiaVet</td>
			<td>218-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary wax</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP4</td>
			<td></td>
			<td>Version 7.0.077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge Tubes (50mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot</td>
			<td></td>
			<td>Version 0.8.9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalCap ALS</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-Tip Forceps</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>TW-CTF-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, &#8805;99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>543047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide 99.9 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Thickness MicroLoops 1000 &#181;m</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M5-L18SP-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FiveEasy pH meter F20-Std-Kit</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30266626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam Dewars Standard Vessel 800 ml</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>M-FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four Color Mounting Clay</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, BioUltra, for molecular biology, &#8805;99.5% (T),</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector</td>
			<td>Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris</td>
			<td>XtaLAB Synergy-R</td>
			<td>Home source X-ray diffractometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Wand Straight</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 &#8211; 20 &#181;L, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks &#215; 96 pcs.)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes volume 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.14-3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Tong 18 mm</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>M-R-1013196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 0.1-2.5 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 100-1000 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 10-100 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Volume 20-200 &#956;L</td>
			<td>Eppendorf Research</td>
			<td>Z683817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR6-146</td>
			<td>Thin-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Stereomicroscope System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>GB-B3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>CV1012</td>
			<td>Thick-walled capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandwich Box with cover</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized 9 Well Glass Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 100 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 20 - 200 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipet Tips, 1 - 20 &#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax pen</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron crystallography data collection and processing for modelling hydrogen atoms in protein structures

중성자 결정예학은 생물학적 거대 분자 내에서 수소 원자 위치를 측정할 수 있는 구조 기술로, 방사선 손상을 유도하지 는 않지만 프로토네이션 및 수화 상태에 대한 기계적으로 중요한 정보를 산출합니다. 반면 X선 회절은 광 원자의 위치에 대한 제한된 정보만 제공하며 X선 빔은 감광성 보조인 및 금속 센터의 방사선 손상을 빠르게 유도합니다. 여기에 제시된 오크 리지 국립 연구소(ORNL)의 IMAGINE 및 MaNDi 빔라인에 사용되는 워크플로우가 적절한 크기의 단백질 결정이 커지면 중성자 회절 구조를 얻습니다(> 0.1 mm3). 중성자 회절 데이터 수집을 위해 석영 모세혈관에 수소화 단백질 결정의 장착을 시연합니다. 또한 중수소가 있는 교환 가능한 현장에서 수소 원자의 교체를 보장하기 위해 D2O 함유 버퍼를 장착한 결정의 증기 교환 공정도 제시된다. 중수소의 통합은 수소 원자의 일관되지 않은 산란으로 인한 배경을 줄이고 부정적인 일관된 산란 길이로 인한 밀도 취소를 방지합니다. 샘플 정렬 및 실온 데이터 수집 전략은 높은 플럭스 동위원소 반응기(HFIR)에서 IMAGINE에서 준 Laue 데이터 수집을 사용하여 설명됩니다. 또한, 황량한 반응 중간체를 트랩하기 위해 극저온 데이터 수집을 위한 액체 질소의 결정 장착 및 신속한 동결은 스발레이션 중성자 소스(SNS)의 MaNDi 비행 시간 계측기에서 입증된다. 모델 좌표 및 회절 데이터 파일 및 중성자 산란 길이 밀도(SLD) 맵의 시각화준비도 해결됩니다. 중성자 데이터 전용 또는 관심 있는 단백질의 모든 원자 구조를 얻기 위한 관절 X선/중성자 데이터에 대한 구조 개선이 마침내 논의될 것이다. 중성자 구조를 결정하는 과정은 글리코시딕 본드의 산화 분열을 통해 반발성 다당류의 분해에 관여하는 구리 함유 금속 단백질인 리시성 다당류 단산소효소 단산소효소 의 결정으로 입증될 것이다.

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Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures

중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

단백질 구조에서 수소 원자 모델링을 위한 중성자 결정학 데이터 수집 및 처리

Neutron crystallography is a structural technique that allows determination of hydrogen atom positions within biological macromolecules, yielding ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

4.8K 조회수.  North Carolina State University. 중성자 단백질 결정학은 수소 원자의 국소화화를 허용하여 단백질 기능의 중요한 기계학적 세부 사항을 제공하는 구조 기술입니다. 우리는 여기에 단백질 결정, 중성자 회절 데이터 수집, 구조 미세 조정 및 중성자 산란 길이 밀도 지도의 분석을 장착하기위한 워크플로우를 제시한다.

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Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

연구

화학

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. Herein, nitrogen is presented as a novel supercritical drying fluid for specialized applications such as in the processing of reactive porous materials, where carbon dioxide and other fluids are not appropriate due to their higher chemical reactivity. Nitrogen exhibits similar physical properties in the near-critical region of its phase diagram as compared to carbon dioxide: a widely tunable density up to ~1 g ml-1, modest critical pressure (3.4 MPa), and small molecular diameter of ~3.6 &#197;. The key to achieving a high solvation power of nitrogen is to apply a processing temperature in the range of 80-150 K, where the density of nitrogen is an order of magnitude higher than at similar pressures near ambient temperature. The detailed solvation properties of nitrogen, and especially its selectivity, across a wide range of common target species of extraction still require further investigation. Herein we describe a protocol for the supercritical nitrogen processing of porous magnesium borohydride.

Nitrogen is an effective supercritical fluid for extraction or drying processes due to its small molecular size, high density in the near-liquid supercritical regime, and chemical inertness. We present a supercritical nitrogen drying protocol for the purification treatment of reactive, porous materials.

반응성이 있음 다공성 물질의 정제를위한 초 임계 질소 처리

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Functionalization of Single-walled Carbon Nanotubes with Thermo-reversible Block Copolymers and Characterization by Small-angle Neutron Scattering

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous solution. In a carbon nanotube/PEO105-PPO70-PEO105 (poloxamer 407) aqueous solution, the amphiphilic poloxamer 407 adsorbs onto the carbon nanotube surfaces and self-assembles into continuous layers, driven by intermolecular interactions between constituent molecules. The addition of 5-methylsalicylic acid changes the self-assembled structure from spherical-micellar to a cylindrical morphology. The fabricated poloxamer 407/carbon nanotube hybrid particles exhibit thermo-responsive structural features so that the density and thickness of poloxamer 407 layers are also reversibly controllable by varying temperature. The detailed structural properties of the poloxamer 407/carbon nanotube particles in suspension can be characterized by small-angle neutron scattering experiments and model fit analyses. The distinct curve shapes of the scattering intensities depending on temperature control or addition of aromatic additives are well described by a modified core-shell cylinder model consisting of a carbon nanotube core cylinder, a hydrophobic shell, and a hydrated polymer layer. This method can provide a simple but efficient way for the fabrication and in-situ characterization of carbon nanotube-based nano particles with a structure-tunable encapsulation.

A method for the functionalization of carbon nanotubes with structure-tunable polymeric encapsulation layers and structural characterization using small-angle neutron scattering is presented.

작은 각도 중성자 산란에 의한 열 가역적 블록 공중 합체 및 특성 단일 벽 탄소 나노 튜브의 기능화

We demonstrate a protocol for single-walled carbon nanotube functionalization using thermo-sensitive PEO-PPO-PEO triblock copolymers in an aqueous ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

보존 과학의 X 선 분말 회절 : 문화 예술에 부식 제품의 일상적인 결정 구조 결정을 향해

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Highly Stable, Functional Hairy Nanoparticles and Biopolymers from Wood Fibers: Towards Sustainable Nanotechnology

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While metal-based nanoparticles are associated with synthetic and environmental hassles, cellulose introduces a green, sustainable alternative for nanoparticle synthesis. Here, we present the chemical synthesis and separation procedures to produce new classes of hairy nanoparticles (bearing both amorphous and crystalline regions) and biopolymers based on wood fibers. Through periodate oxidation of soft wood pulp, the glucose ring of cellulose is opened at the C2-C3 bond to form 2,3-dialdehyde groups. Further heating of the partially oxidized fibers (e.g., T = 80 &#176;C) results in three products, namely fibrous oxidized cellulose, sterically stabilized nanocrystalline cellulose (SNCC), and dissolved dialdehyde modified cellulose (DAMC), which are well separated by intermittent centrifugation and co-solvent addition. The partially oxidized fibers (without heating) were used as a highly reactive intermediate to react with chlorite for converting almost all aldehyde to carboxyl groups. Co-solvent precipitation and centrifugation resulted in electrosterically stabilized nanocrystalline cellulose (ENCC) and dicarboxylated cellulose (DCC). The aldehyde content of SNCC and consequently surface charge of ENCC (carboxyl content) were precisely controlled by controlling the periodate oxidation reaction time, resulting in highly stable nanoparticles bearing more than 7 mmol functional groups per gram of nanoparticles (e.g., as compared to conventional NCC bearing &#60;&#60; 1 mmol functional group/g). Atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM), and scanning electron microscopy (SEM) attested to the rod-like morphology. Conductometric titration, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS), electrokinetic-sonic-amplitude (ESA) and acoustic attenuation spectroscopy shed light on the superior properties of these nanomaterials.

Synthesis schemes to prepare highly stable wood fiber-based hairy nanoparticles and functional cellulose-based biopolymers have been detailed.

매우 안정, 기능 털이 나노 입자와 목재 섬유에서 생체 고분자 : 지속 가능한 나노 기술쪽으로

Nanoparticles, as one of the key materials in nanotechnology and nanomedicine, have gained significant importance during the past decade. While ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

전기 화학 임피던스 분 광 전기 화학 속도 상수 추정을 위한 도구로

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part of the Properties of Actinides under Extreme Conditions laboratory (PAMEC), allows the preparation of films and studies of sample surfaces using surface analytical techniques such as X-ray and ultra-violet photoemission spectroscopy (XPS and UPS, respectively). All studies are made in situ, and the films, transferred under ultra-high vacuum from their preparation to an analyses chamber, are never in contact with the atmosphere. Initially, a film of UO2 is prepared by direct current (DC) sputter deposition on a gold (Au) foil then oxidized by atomic oxygen to produce a UO3 film. This latter is then reduced with atomic hydrogen to U2O5. Analyses are performed after each step involving oxidation and reduction, using high-resolution photoelectron spectroscopy to examine the oxidation state of uranium. Indeed, the oxidation and reduction times and corresponding temperature of the substrate during this process have severe effects on the resulting oxidation state of the uranium. Stopping the reduction of UO3 to U2O5 with single U(V) is quite challenging; first, uranium-oxygen systems exist in numerous intermediate phases. Second, differentiation of the oxidation states of uranium is mainly based on satellite peaks, whose intensity peaks are weak. Also, experimenters should be aware that X-ray spectroscopy (XPS) is a technique with an atomic sensitivity of 1% to 5%. Thus, it is important to obtain a complete picture of the uranium oxidation state with the entire spectra obtained on U4f, O1s, and the valence band (VB). Programs used in the Labstation include a linear transfer program developed by an outside company (see Table of Materials) as well as data acquisition and sputter source programs, both developed in-house.

U2O5 Film Preparation via UO2 Deposition by Direct Current Sputtering and Successive Oxidation and Reduction with Atomic Oxygen and Atomic Hydrogen

This protocol presents the preparation of U2O5 thin films obtained in situ under ultra-high vacuum. The process involves oxidation and reduction of UO2 films with atomic oxygen and atomic hydrogen, respectively.

UO2 증 착 직류 스퍼터 링 및 연속 산화와 산소 원자와 원자 수소 감소를 통해 U2O5 영화 준비

We describe a method to produce U2O5 films in situ using the Labstation, a modular machine developed at JRC Karlsruhe. The Labstation, an essential part ...

Experimental Methods for Efficient Solar Hydrogen Production in Microgravity Environment

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the Earth's atmosphere. So-called 'solar fuel' devices, currently developed for terrestrial applications in the quest for realizing a sustainable energy economy on Earth, provide promising alternative systems to existing air-revitalization units employed on the International Space Station (ISS) through photoelectrochemical water-splitting and hydrogen production. One obstacle for water (photo-) electrolysis in reduced gravity environments is the absence of buoyancy and the consequential, hindered gas bubble release from the electrode surface. This causes the formation of gas bubble froth layers in proximity to the electrode surface, leading to an increase in ohmic resistance and cell-efficiency loss due to reduced mass transfer of substrates and products to and from the electrode. Recently, we have demonstrated efficient solar hydrogen production in microgravity environment, using an integrated semiconductor-electrocatalyst system with p-type indium phosphide as the light-absorber and a rhodium electrocatalyst. By nanostructuring the electrocatalyst using shadow nanosphere lithography and thereby creating catalytic 'hot spots' on the photoelectrode surface, we could overcome gas bubble coalescence and mass transfer limitations and demonstrated efficient hydrogen production at high current densities in reduced gravitation. Here, the experimental details are described for the preparations of these nanostructured devices and further on, the procedure for their testing in microgravity environment, realized at the Bremen Drop Tower during 9.3 s of free fall.

Efficient solar-hydrogen production has recently been realized on functionalized semiconductor-electrocatalyst systems in a photoelectrochemical half-cell in microgravity environment at the Bremen Drop Tower. Here, we report the experimental procedures for manufacturing the semiconductor-electrocatalyst device, details of the experimental set-up in the drop capsule and the experimental sequence during free fall.

미세 중력 환경에서 효율적인 태양 수소 생산을위한 실험 방법

Long-term space flights and cis-lunar research platforms require a sustainable and light life-support hardware which can be reliably employed outside the ...