이 연구는 미세 유체 시스템에서 직접 전류 펄스 자극에 의해서만 유도되는 신경 전구체 세포의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 실험 설정 시간, 샘플 볼륨 및 시약 볼륨을 줄이는 데 유익한 접근 방식을 제공합니다. 또한, MOE 칩은 공초점 현미경 관측에 적합합니다.
간단한 직접 전류 펄스 치료는 마우스 신경 전구체 세포의 운명을 통제할 수 있고 신경계 무질서를 위한 치료 전략을 개발하는 데 이용될 수 있었습니다. 시작하려면 적절한 소프트웨어를 사용하여 개별 PMMA 레이어및 양면 테이프에 대한 패턴을 그립니다. 이산화탄소 레이저 스크라이브를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다.
소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다. PMMA 시트 또는 양면 테이프를 레이저 스크라이브 플랫폼에 놓은 다음 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저를 집중시합니다. 프린터로 레이저 스크라이브를 선택한 다음 레이저 스크라이브를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작합니다.
PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소하십시오. PMMA 시트의 여러 층을 결합하기 위해, 1mm PMMA 시트의 세 조각을 스택하고 흐름 또는 전기 자극 채널 조립을 형성하기 위해 110섭에서 30 분 동안 열 본더에 평방 센티미터 당 5 킬로그램의 압력으로 결합합니다. 빠른 작용 시아노아크라일트 접착제와 MOE 칩 어셈블리 중 하나에 개별 개구부에 어댑터 12 개를 부착합니다.
칩 조립 하기 전에 30 분 동안 자외선 조사를 사용 하 여 1 밀리 미터 PMMA 기판, 양면 테이프 및 3 밀리 미터 광학 등급 PMMA를 소독. PMMA 어셈블리를 완료하기 위해 양면 테이프로 3밀리미터 광학 등급 PMMA의 1mm PMMA 기판을 부착합니다. 양면 테이프로 청소된 커버글래스를 PMMA 어셈블리에 부착합니다.
흰색 손가락 꽉 플러그와 함께 한천 교량 어댑터의 개구부를 밀봉합니다. 중간 입구 및 콘센트 어댑터를 통해 평평한 하단 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결한 다음 콘 루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다. 중간 입구의 3방향 스톱콕에 연결되는 3밀리리터 주사기를 사용하여 0.01%PLL 용액 2개를 추가하고 빈 3밀리리터 주사기를 중간 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결합니다.
PLL 용액으로 세포 배양 영역을 채우고 코팅 용액을 앞뒤로 천천히 펌핑합니다. 문화 권 내의 용액을 밀봉하기 위해 두 개의 3 방향 스톱콕을 닫습니다. 5%의 이산화탄소 대기로 채워진 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 MOE 칩을 37도의 인큐베이션으로 배양합니다.
두 개의 3방향 스톱콕을 열고 두 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 수동으로 펌핑하여 채널의 거품을 제거합니다. 3밀리리터의 완전한 배지를 3밀리리터를 3밀리리터 주사기에 넣고 매질의 3방향 스톱콕에 연결하고 세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하도록 추가한다. 흰색 손가락꽉 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 어댑터를 채우기 위해 3% 뜨거운 아가로즈를 주입합니다.
Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결하고 검은 고무 봉을 통해 3 % 뜨거운 아가로즈를 주입하여 Luer 잠금 주사기를 채웁니다. 아가로즈가 식히고 굳히는 데 10-20분을 허용하십시오. 37°C에서 유지되는 프로그래밍 가능한 XYZ 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다.
mNPC를 중형 콘센트를 통해 MOE 칩으로 수동으로 펌핑한 다음 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 4시간 동안 배양합니다. 전기 전선을 사용하여 칩의 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 기능 발생기를 증폭기와 연결하여 출력 사각파 DC 펄스를 제공합니다.
MOE 칩의 모든 평평한 바닥 커넥터와 어댑터를 제거하고 어댑터를 PBS로 채운 다음 어댑터 개구부를 파라필름으로 밀봉합니다. 면역 염색 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰한다. DC 펄스 자극은 줄기 세포 유지 보수 매체에서 뉴런, 성상세포 및 올리고드엔드로키테로 분화되는 동시 mNPC의 결과.
신경세포의 백분율, 성상세포, 및 올리고드엔드로시테스의 대조군과 자극 단에서 여기에 표시됩니다. DC 펄스 처리 후, mNNP는 DIV 7에서 상당히 많은 수의 뉴런을 표현했고, DIV 3의 성상세포, DIV 7 및 DIV 14의 올리고드엔드로키테스는 대조군보다 자극 군에서 상대적으로 높은 수준으로 존재하였다. 30~40개의 세포에 의해 형성된 신경구는 mNPC 분화를 개시하기 위해 바람직하다.
mNPC의 과성장은 분화 과정에서 세포 생존을 손상시킬 것이다.
