미토콘드리아는 호기성 호흡을 할 수 있는 진핵세포의 필수 세포입니다. 그들의 기능 장애는 인간 질병의 잘 알려진 소스. 베이커의 효모 미토콘드리아는 8개의 단백질을 인코딩하는 원형 게놈을 포함합니다.
본 비디오에서는, 우리는 번역 제품의 방사성 라벨링 및 겔 전기포고에 의한 후속 분리를 통해 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 분석하는 데 사용되는 프로토콜을 설명했습니다. 절차에는 몇 가지 주요 단계가 포함됩니다. 적절한 매체와 신선한 접시에 냉동 재고 문화에서 효모를 줄입니다.
24~48시간 동안 배양인을 30도에서 30도로 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에서 신선한 줄무늬에서 매체의 두 밀리리터에 이러한 문화를 접종하고 30도에서 200 RPM에서 하룻밤 교반을 배양. 600 나노미터의 파장에서 배양의 광학 밀도를 측정합니다.
실온에서 30초 동안 9, 000G에서 멸균 튜브 팔레트 효모 셀에서 0.2 흡수장치에 해당하는 부피를 복용하십시오. 이 상체를 폐기하십시오. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면.
실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다. 신선한 닦아 한천 매체의 두 밀리리터에 세포를 희석.
광학 밀도가 1.5에서 1.9값으로 1.5에서 1.9로 도달할 때까지 200 RPM 및 30도에서 가져온 인큐베이션 엣지. 마이크로 원심분리기 튜브의 하나의 광학 장치에 해당하는 배양 량을 전송합니다. 튜브를 3000 G에서 1분 동안 회전시합니다.
상부체를 폐기합니다. 5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포는 상피셀을 폐기합니다.
멸균 번역 버퍼의 0.5 밀리리터에서 효모 세포를 다시 중단합니다. 서스펜션을 15 밀리리터 튜브에 놓습니다. 세포 현탁액에 사이클로헨시미드를 200 RPM 및 30도에서 5분 동안 밀리리터 인큐베이터당 0.2 밀리그램의 최종 농도까지 세포 현탁액에 추가하여 세포 변환을 억제합니다.
S35 메티오닌의 S35 메티오닌의 25 ~30 마이크로큐리에서 25 ~ 30 마이크로큐리를 세포 현탁액에 넣고 200 RPM 및 30도에서 30분 동안 에큐베이트합니다. 라벨이 부착되지 않은 차가운 메티오닌과 보리미신을 추가하여 200 RPM과 30도에서 10분 동안 라벨이 붙는 인큐베이터를 중지합니다. 30초 동안 9, 000G에서 원심분리로 효모 세포를 수집합니다.
5 초 동안 소용돌이를 통해 멸균 수의 0.5 밀리리터로 세포를 씻으시면. 실온에서 30초 동안 9, 000 G의 Pallette 효모 세포. 상부체를 폐기합니다.
팔레트와 소용돌이에 75 마이크로리터의 용액 을 5~10초 간 추가합니다. pH 6.8로 0.5 어어 트리버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. pH 6.8.
소용돌이가 짧게. 샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이.
샘플에 150 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 12, 000 G.에서 2 분 동안 샘플을 원심 분리하여 샘플러로 오파페이스를 조심스럽게 폐기하십시오.
샘플에 메탄올 600 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 여러 번 반전시켜 조심스럽게 섞는다. 원심분리기 샘플은 12, 000 G.에서 2분 동안 시료를 폐기합니다.
80도에서 2분간 파렛을 공기가 건조시다. Laemmli 샘플 버퍼의 60 마이크로 리터에 침전 된 단백질을 녹입니다. 샘플을 14도에서 10분간 가열합니다.
17.5%의 Laemmli SDS 폴리아크라이글라미드 젤을 생성합니다. 주머니에 각 샘플의 15 마이크로 리터를로드합니다. 파란 염료가 젤 림프의 약 65 %에 도달 할 때까지 차가운 방에서 젤을 실행합니다.
구마티 스티글 블루로 젤을 염색하고 로딩 컨트롤에 필요한 스캔이나 사진을 만듭니다. 젤 건조기에서 젤을 건조시십시오. 3~5일 동안 보관 형인 스크린으로 카세트에 보관하십시오.
인광 선상에서 화면을 스캔합니다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라, 우리는 두 개의 사카로미세스 세레비시아균에서 미토콘드리아 번역 제품을 할당했습니다. 미토콘드리아 번역 개시 인자 3을 인코딩하는 Aim23 유전자의 야생 유형 및 돌연변이 변이체 삭제.
미토콘드리아 번역 제품은 이미 폴리아크릴아미드 겔에서 적극적으로 표지되고 분리되었다. 샘플은 채도 가 되기 전에 2분 반마다 수집되어 시간 과정을 구축했습니다. 젤은 5일 박람회 후 염색, 건조 및 스크리닝되었다.
성공적인 실험의 경우, 그림은 표준 패턴에 따라 할당 된 8 개의 밴드를 보여줍니다. 그러나, 개별 밴드의 강도는 변형 및 실험 조건에 따라 매우 가변적일 수 있다. 각 밴드는 하나의 번역 제품에 해당합니다.
데이터는 야생 모형에 나타나는 모든 제품이 이 돌연변이에서 보이기 때문에 돌연변이 균주가 미토콘드리아 단백질 합성이 가능하다는 것을 건의합니다. 그러나, 밴드의 강도는 야생 유형과 다르며, 이는 Aim23의 이러한 삭제가 미토콘드리아 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 쿠마시 블루 얼룩으로 양조하였고 로딩 컨트롤역할을 합니다.
이미지 G 또는 Image Quan 소프트웨어를 사용하여 균주 또는 실험 조건 간의 차이점을 식별하기 위해 데이터를 정량화할 수 있습니다. 이를 위해, 모든 제품에 대응하는 신호의 비율은 총 신호로 계산된다. 평균 값 및 표준 편차는 적어도 세 번의 독립적인 실험에서 계산됩니다.
인계된 합성 단백질의 운동학은 지난 해의 실험에서 연구됩니다. 샘플은 차가운 메티오닌과 보리마이신에 의해 라벨링 반응이 중단된 후 표시된 시점에서 수집됩니다. 이 제어는 제품의 안정성을 추정하기 위해 필요합니다.
항 포린 을 가진 면역 염색은 1개의 항체를 가진 로딩 통제입니다. 우리는 효모 미토콘드리아에서 단백질 생합성을 연구하는 데 자주 사용되는 방법을 설명했습니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하고 빠르게 수행할 수 있습니다.
동시에, 매우 유리한 4 개의 효모 미토콘드리아 mRNAs의 번역 속도에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나, 그것은 추가 실험을 필요로 하는 몇 가지 제한이 있으며 단백질과 mRNA의이 주간 수준에 거짓말. 미토콘드리아 번역 시스템에서 이러한 기능에 대한 정보를 제공할 수 있지만 메커니즘을 발견하기 위해 보다 진보된 기술을 사용해야 합니다.
