이 프로토콜은 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 중 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 제출된 국소화를 결정하도록 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 성장 조건에서 유지되는 효모 균주에 적합합니다. 미토콘드리아를 연구하는 것으로 연구를 위한 강력한 도구를 대표합니다.
우선, 80C에 저장된 글리세롤 스톡의 줄무늬 세포가 YPD 한천 판에 들어가서 단일 콜로니를 관심있는 변형으로부터 분리합니다. 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 C에서 플레이트를 배양하십시오. YPGal 배지 10~30ml를 함유한 100ml 에렌마이어 플라스크에서 YPD 사마접시에서 2~3개의 개별 콜로니를 접종하여 스타터 컬쳐를 준비합니다.
플라스크를 30C에서 24시간 동안 인큐베이팅하여 180~200rpm에서 격렬한 흔들림을 합니다. 스타터 배양을 신선한 YPGal 배지 의 1L로 희석하여 600 nm에서 0.1 미만의 광학 밀도로 희석합니다. 광학 밀도가 1 에서 1.5에 도달할 때까지 약 180 에서 200 rpm에서 약 12 시간 동안 활발한 흔들림으로 30 C에서 세포를 재배하십시오.
텍스트에 설명된 바와 같이 고도로 정제된 미토콘드리아의 분리를 수행한다. 그리고 제조 업체의 지시에 따라 브래드포드 분석기를 사용하여 고도로 정제 된 미토콘드리아 제제의 단백질 농도를 결정합니다. 얼음 차가운 SEM 버퍼로 단백질 농도를 10 mg/ml로 조정합니다.
고도로 정제된 미토콘드리아 40l을 1.5ml의 사전 냉장 및 표지된 미세원심분리기 튜브 4개로 옮춥니다. 첫 번째 및 두 번째 튜브에 360 l의 SEM 버퍼를 추가합니다. 그리고 제 3 및 네 번째 튜브에서 EM 버퍼의 360 l.
텍스트에 따라 파이펫팅 방식을 사용하여 두 번째 및 네 번째 튜브에 갓 준비된 단백질 Ase K 4 L을 추가합니다. 모든 튜브를 부드럽게 혼합한 후, 가끔 섞어 30분 동안 얼음에 배양합니다. 단백질Ae K 활성을 중지하려면 4개의 튜브모두에 200mM PMSF의 4L을 추가합니다.
4C.에서 30 분 동안 20, 000 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.5 ml 미리 차가운 라벨 마이크로 센시드 퍼지 튜브로 슈퍼 네티컬을 수집합니다. 다음으로, 얼음 차가운 SEM 버퍼 400l에서 펠릿을 다시 놓습니다. 단백질제 K의 가능한 흔적을 비활성화하려면 수집된 수퍼나탈을 침전시키고 트리클로로아세트산으로 펠릿을 10%의 최종 농도로 10분간 얼음에 튜브를 배양한다.
원심분리제 는 4C.에서 12, 000 x g에서 10 분 동안 처리 된 트리클로로아세트산 샘플을 원심 분리하고 상퍼를 제거 한 후 200 l의 샘플 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 브로모페놀 블루가 노란색으로 변하면 1M Tris 베이스의 1~5l을 추가하여 파란색으로 바뀝니다. 모든 튜브에 200mM PMSF 4l을 추가합니다.
SDS PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 샘플을 80C로 저장합니다. 고도로 정제된 미토콘드리아 200l을 1.5ml의 미리 차가운 미세 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 미토콘드리아를 얼음으로 차가운 SEM 버퍼로 1배 희석합니다.
소량과 호환되는 초음파 처리기를 사용하여 미토콘드리아를 얼음에서 30초 동안 3번 초음파 처리합니다. 원심분리기 는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 원심 분리하고 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 센심 분리기 튜브에서 상체를 수집합니다. 튜브를 용해성 단백질 분획에 대한 S"로 표시한 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 재중단 된 펠릿 100 l을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리 튜브로 옮춥니다. 튜브를 SMP로 라벨을 부착하여 입자 분획을 제출하고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
나머지 300l의 재질펠릿을 1배, 갓 준비한 200mMM 나트륨 탄산나트륨으로 희석시키십시오. 그리고 30 분 동안 얼음에 희석 된 샘플을 배양. 그런 다음, 원심 분리는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 수집합니다.
탄산염 상수 분획에 대한 CS"로 샘플을 라벨, 얼음에 튜브를 유지. 얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 탄산염 침전 분획에 대한 CP"로 샘플을 이름.
삼중염산으로 모든 샘플을 10%의 최종 농도로 침전시키고 10분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다. 이어서, 4C.에서 12, 000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 후, 샘플 버퍼의 각 펠릿을 재연한다. 샘플 버퍼가 노란색이 되면 파란색으로 바뀔 때까지 1~5l의 M Tris 베이스를 추가합니다.
SDS-PAGE와 웨스턴 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 튜브에 200mM PMSF 1l을 추가하고 80C에 저장합니다. 조미토콘드리아 분획은 자당 밀도 그라데이션 원심분리에 정제되었고, 다른 세포 오염물질의 감소가 관찰되었다. 미토콘드리아는 골레에서 막간 공간 단백질 사이토크롬 b2의 실종에 의해 미토콘드리아를 모니터링하였다.
상수에 수반되는 모습. 상기 단백질Ae K는 막 간 단백질 Sco1의 분해를 삼투성 쇼크에 의한 외부 막 중단으로 인해 관찰하였다. 외부 미토콘드리아 멤브레인 무결성은 펠릿 분획에서 단백질Ae K 분해에 대한 시토크롬 b2 및 스코1의 보호에 의해 확인되었다.
유사하게, 매트릭스 수용성 단백질 KGD의 보호는 내부 미토콘드리아 막 무결성을 확인하였다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 간 공간과 매트릭스에서 이중 미토콘드리아 국소화를 제안했습니다. 미토콘드리아는 막 단백질의 토폴로지를 조사하기 위해 초음파 처리 및 탄산염 추출을 실시하였다.
부어 지는 일체형 멤브레인 단백질은 펠릿 분획에 남아 있었다. KGD는 상류분획에서 검출되었다. 펠릿에서 KGD 단백질의 검출은 중소기업의 형성에 영향을 미치는 초음파 처리 파라미터 변이 때문이었다.
탄산나트륨 처리 후, KGD및 SMP 분획은 용해화되어 상류분획에서 발견되었다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 주변과의 연관성을 제안했습니다. 제출된 분별 프로토콜의 성공을 위해, 샘플에 PMSF를 추가하여 저근증 부종 후 단백질활성을 중지하는 것이 중요하다.
사이트는 제출 단백질 현지화에 대한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 미토콘드리아 서브구획의 proteomic 연구 도중 근본적인 미토콘드리아 준비의 무결성을 확인하는 것을 이용될 수 있습니다.
