이 방법을 통해 연구자는 기저 전뇌와 얼굴 사이의 조직 상호 작용을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 평가를 위해 기저 전뇌를 분리하고 분석을 혼란스럽게 하는 신경 능선 세포로 인한 오염을 방지한다는 것입니다. 이 기술의 어려운 부분은 숙주에서 전뇌를 제거하고 기증자 조직으로 대체하는 것입니다.
이 절차를 시연하는 것은 Ralph Marcucio 박사 실험실의 연구 과학자 인 Diane Hu가 될 것입니다. 시작하려면 중성 적색, 유리 전사 피펫 및 날카롭게 깎은 텅스텐으로 DMEM 매체를 준비합니다. 10 밀리리터 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여 달걀 껍질의 뾰족한 끝에서 0.5 밀리리터의 알부민을 제거합니다.
가위를 사용하여 껍질 위에 작은 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 구멍 위에 테이프를 붙이고 원형 구멍을 잘라 배아를 노출시킵니다. 배아를 중성 빨간색으로 얼룩지게하십시오.
7기 또는 8기 배아의 기저 전뇌의 왼쪽에서 조직 이식편을 채취합니다. 구부러진 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 전뇌 조각을 부드럽게 절개합니다. 밑에 있는 내배엽을 포함하지 않으려면 바늘을 전뇌 아래로 밀어 신경관의 축과 평행하게 만듭니다.
유리 전사 피펫을 사용하여 기증자 배아에서 이식편을 채취하고 2분 동안 중성 적색이 포함된 DMEM에 옮겨 염색합니다. 그런 다음 염색된 이식편을 생착 준비가 될 때까지 중성 빨간색을 포함하지 않는 DMEM에 놓습니다. 섭씨 37도의 흰색 레그혼 닭의 수정란을 가습실에서 햄버거-해밀턴 7-8단계까지 배양합니다.
이전에 시연 된대로 배아를 노출시킵니다. 뾰족한 텅스텐 바늘을 사용하여 이식편을 수용하기 위해 0.3 x 0.2mm 기저 전뇌 조각을 절단한 다음 제거하여 이식편 부위를 준비합니다. 밑에 있는 내배엽의 과도한 파열을 피하십시오, 이는 난황 과립이 만들어진 모든 눈물을 통해 누출되기 시작할 때 분명합니다.
이식편을 숙주로 옮긴 후 숙주의 절제된 기저 전뇌를 대체하기 위해 이식편을 배치합니다. 구멍 위에 테이프를 단단히 붙이고 분석 준비가 될 때까지 배아를 섭씨 37도 인큐베이터로 되돌립니다. 처음에는 키메라가 메추라기 조직을 병아리 배아에 이식하여 만들어졌습니다.
QCPN 항체를 사용하여, 메추라기 세포를 가시화하고, 숙주 조직으로부터 구별하였다. 메추라기-병아리 시스템은 모든 이식편이 신경 조직으로만 구성되어 있고 다른 세포 유형으로 오염되지 않았음을 확인했습니다. 오리 배아에 메추라기 조직을 이식하면 메추라기 뇌가 더 빨리 발달하여 키메라가 심하게 변형되었습니다.
따라서 오리 조직을 닭 배아에 이식하는 것이 수행되었습니다. 그 결과 오리 병아리 키메라는 뇌가 형태 조절에 참여한다는 것을 암시합니다. 키메라에서 소닉 고슴도치 발현을 평가하기 위해 전체 산 C2 혼성화를 사용했습니다.
형태와 유사하게, 키메라의 오리 쪽에 있는 소닉 고슴도치 표정은 더 오리처럼 보였습니다. 호스트 사이트를 준비하려면 연습이 필요합니다. 많은 수의 배아가 생존하지 못하므로 많은 수의 키메라를 생성하면 분석을 위한 적절한 샘플을 확보하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법을 통해 뇌의 신호가 전두엽 외배엽 영역에서 소닉 고슴도치 발현 영역을 형성하는 방법을 평가할 수 있었습니다.
