mRNA 전기기는 조류 모델 시스템 내에서 여러 단백질의 빠르고 효율적이며 공간적으로 제어되는 발현을 제공합니다. 이 방법은 표준 DNA 전기화에 의해 달성된 라벨링보다 형광 단백질의 더 광범위하고 빠른 발현을 허용합니다. 전기 기공은 수많은 모형 유기체의 세포로 RNA 및 DNA 같이 유전 페이로드의 전송을 위한 통로 역할을 하는 플라즈마 막에 있는 기공의 일시적인 개방을 용이하게 합니다.
초기 실험의 경우 전기화와 같은 외부 조작에 더 강하고 저항력이 있기 때문에 하루 이상 된 배아로 작동합니다. 적절한 배아 발달 단계에서 메추라기 달걀 내용물을 부드럽게 깨고 10센티미터 페트리 접시에 붓습니다. 전송 파이펫을 사용하여 두꺼운 알부민의 대부분을 제거합니다.
실험실 조직을 사용하여 요크 표면을 부드럽게 닦아 배아 주위에 남아있는 두꺼운 알부민을 제거하여 배아가 종이 고리에 단단히 붙일 수 있도록하십시오. 배아 위에 미리 절단된 필터 용지를 놓고 가위를 사용하여 배아의 둘레를 부드럽게 자른다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 부드러운 스트림을 사용하여 배아 밑에 PPS를 레이어링하여 조직에 달라붙는 멍에를 비우세요.
배아 종이 링을 멍에의 경사 각도로 천천히 당깁니다. 종이를 PBS로 가득 찬 페트리 접시에 넣고 추가 청소를 합니다. 대부분의 요크가 제거되면 배아 복부 면을 35mm 페트리 접시에 넣고 한천과 알부민의 반고체 혼합물로 덮여 놓습니다.
흑전극을 PBS로 채우고 배아를 내부에 배치하여 전기 포기 챔버를 준비합니다. 유리 마이크로모세필리를 사용하여 200나노리터의 mRNA를 에피블라스트와 원하는 영역을 덮는 비텔린 멤브레인 사이의 구멍에 주입한다. 그리고 적전극을 사용하여 배아를 전극합니다.
전기포고이드 배아를 한천 알부민 혼합물에 다시 놓고 원하는 발달 단계까지 섭씨 38도에 배양한다. 전기 포기 -인코딩 형광 단백질의 이미징을 위해 동적 이미징 실험을위한 가장 건강하고 가장 좋은 전기 화 배아를 선택하기 위해 형광 해부 스테레오스코프의 모든 전기 화 배아를 관찰합니다. 별도의 인큐베이터에서 다른 전기도금 배아 및 비 전자도판 배아를 계속 배양합니다.
PBS로 선택된 배아를 간략하게 헹구면 전기기화 중에 배아의 등쪽에서 형성되었을 수 있는 기포를 제거한다. 청소된 배아는 배아의 등대 표면에 거품을 일으키지 않도록 주의하는 알부민-한천의 약 150마이크로리터의 얇은 층을 포함하는 이미징 접시에 직접 놓습니다. 이미징 접시의 안쪽 가장자리를 따라 작은 촉촉한 롤업 티슈 페이퍼를 추가합니다.
파라핀 필름으로 접시를 밀봉하여 이미징 및 인큐베이션 중 증발을 최소화합니다. 접시를 공초점 현미경의 예동 된 단계로 빠르게 이동하고 밝은 필드 채널을 사용하여 배아의 착색 염료를 찾습니다. 이미징 소프트웨어를 원하는 목표, 이색 거울 및 방출 스펙트럼으로 설정하고 적절한 레이저를 켭니다.
세포가 영화 전체에 대한 이미지 시야에 남아 있음을 주의하십시오. 충분히 높은 이미징 해상도를 사용하고 이미징 상태가 광독성을 유발하지 않도록 하십시오. 이미징 소프트웨어에서 라이브를 클릭하고 각 현미경 레이저 전력에 따라 형광 강도에 적합한 설정으로 레이저 전력을 조정합니다.
1%레이저 파워와 800게인을 사용하여 배아를 이미징하기 시작하여 포화 픽셀이 보일 때까지 레이저 전력을 1% 증가시면 천천히 증가합니다. 포화 픽셀이 관찰되면 포화 픽셀이 시각화될 때까지 레이저 전력이 약간 감소합니다. 배아가 이미징 세션 중에 아가로즈 침대로 가라앉을 경우, 전체 전기도금 영역의 5마이크로미터 Z 스택을 사용하여 3~5분마다 배아를 이미지하여 전체 전기도금 영역의 5마이크로미터 Z-스택을 사용하여 개별 세포의 이주를 확인합니다.
셀이 이동하는 속도 관찰하려면 첫 번째 영화의 처음 몇 시간 지점을 확인합니다. 세포가 빠른 속도로 이동하는 경우, 이미지 영역의 확대/축소를 확장하거나 다른 영역을 이미징하는 것이 좋습니다. 배아의 전체 전기도금 영역이 이미지되었을 때, 자가형경화 수준을 결정하기 위해 동일한 배아의 전기도금 되지 않은 영역에서의 이미지.
전염된 mRNA가 스테레오 현미경에 대한 관심 유전자의 전기포공을 확인한 후 형광단백질로 얼마나 오래 번역될 수 있는지를 결정하기 위해, 배구를 반전된 공초점 현미경의 예열된 단계에 배치하고, 세포형 광판지의 70%레이저 출력, 100회 반복, 그리고 4개의 스캔 속도를 셀룰러 전기전도의 대부분에 걸쳐 사용한다. 사진 표백 후 36도에서 단계에서 배아를 계속 배양하고, 일반적으로 건강한 배아에서만 볼 수 있는 광표백 부위 내에서 활발하게 분할되는 세포에 주의를 기울이고, 따라서 전기기공이 배아 세포에 해를 끼치지 않았음을 나타낸다. 일반 3~5분 간격으로 원하는 시간 동안 전기도금 영역의 표백제 Z 스택 이미지를 획득합니다.
이미징 조건이 이미징에 대한 대조군역할을 하기 위해 광표백되지 않은 동시에 배아 생존에 영향을 미치지 않도록 하기 위해. mRNA 붕괴 후 전기화에 대한 광표백 결과를 양수화하기 위해 ImageJ는 각 세포의 전기도금 영역의 중심에서 7.5 마이크로미터 원의 형광 강도를 측정하여 각 3~5분 간격에 걸쳐 세포 형광을 추적한다. 미토시스를 거치지 않고 완전히 광표백된 광표백 부위 내의 모든 세포가 측정되었을 때, 각 시간 지점에서 표백 후 시간 마다 형광 강도를 플롯하여 배아가 표백하였다.
DNA 전기기화는 몇몇 전기도금 세포에 있는 밝은 형광으로 이끌어 내더라도, DNA 전기기화의 효율성은 널리 표현된 mRNA-인코딩형 형광 단백질에 비해 눈에 띄게 낮습니다. 동일한 배아 내에서 DNA와 mRNA 의 동시 전기포화를 비교할 때, 형광 단백질 효율을 표현하는 DNA는 형광 단백질을 표현하는 mRNA보다 유의하고 일관되게 효율이 낮습니다. 만 mRNA, DNA 또는 둘의 조합으로 전기도상화된 모든 배아의 정량화는, DNA는 세포의 대략 25%를 transfects 하는 동안, 주어진 지역에 있는 세포의 대략 75%를 암RNA transfects는 것을 밝힙니다.
전감염된 mRNA는 mRNA가 세포경 번역 기계에 의해 즉시 인식될 수 있기 때문에 전감염된 DNA에 비해 더 빠른 단백질 생산으로 이끌어야 한다. 다중 DRNA의 공동 전기포지는 이전에 상대적으로 비효율적이기 는 않았지만, 본 실험에서 4mRNA의 공동 전기화는 모든 전기도금 영역 내에서 4개의 mRNA 의 87%의 전율 효율을 초래하였다. 광표백은 처음에 대략 95%에 의하여 광표백된 세포에 있는 형광 강도를 감소시키지만 몇몇 세포는 전기기화 직후형 단백질을 분할하고 표현하는 그들의 능력을 복구하는 남아 있습니다.
그러나 이 능력은 전기기 후 5시간 이상 감소합니다. 최고의 이미징 조건을 최적화하는 데 시간을 할애하고 필요한 경우 조정을 할 준비가 된 영화를 시작한 후에도 계속 땜질을 하십시오.
