이 체외 이미징 분석은 microglial phagocytosis에 다른 세포 치료 또는 다른 유전자형의 효과를 정량화 할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환과 관련된 두 가지 세포 유형을 사용하여, 우리는 식세포화물에 죽은 신경 아세포종 세포를 사용하며, 이는 큰 함량이 높은 이미징 스크린에 의해 쉽고 저렴하게 확장 될 수있는 방식으로 제조됩니다. 클래스 2 생물학적 안전 캐비닛에서, 배지를 흡입하여 SH-SY5Ys를 해리.
세포 해리 버퍼 4ml를 추가하고 버퍼를 즉시 제거하여 1ml 미만이 세포를 코팅하는 박막으로 남아 있도록합니다. 섭씨 37도에서 2~3분, 이산화탄소 5%를 배양합니다. 그런 다음 10 ml의 HBSS에서 T-75 플라스크에.
그리고 SH-SY5Ys를 15ml 원심분리기 튜브에 파이펫합니다. 400xG의 원심분리기는 5분 동안. 수퍼네티드를 흡인시키고, 페놀 무적HEPES 버퍼링 된 미디어의 2 ml에서 세포를 다시 일시 중단하여 고정하기 전에 덩어리를 분해하십시오.
튜브에 4%의 파워 포름알데히드 2ml를 추가하고 가끔 부드러운 동요로 실온에서 10 분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 튜브에 10ml의 HBSS를 추가합니다. 그런 다음 1200xG에서 7 분 동안 원심 분리기.
슈퍼나탄을 흡인시키고, 페놀 무적HEPES 버퍼링 된 매체의 2 ml에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 100만 개의 HS-SY5Y 세포를 2ml 저단백질 결합 튜브로 카운트 앤 제거합니다. 페놀 레드 프리 HEPES 버퍼링 미디어를 사용하여 총 볼륨을 300~500 마이크로리터로 가져옵니다.
그런 다음 37도의 수조에서 튜브를 잠시 따뜻하게 합니다. pH 에민감한 적색 형광염 염료 STP 에스테르를 제조업체의 지시에 따라 재구성하십시오. 그런 다음 백만 SH-SY5Y 세포당 12.5 마이크로그램의 염료를 추가합니다.
튜브를 가볍게 저어 부드럽게 섞습니다. 그리고 실내 온도에서 30 분 동안 튜브를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 1200xG에 HBSS와 원심분리기 1ml를 7분 4도에 추가합니다.
상부체를 폐기합니다. 그리고 HBSS 2 ml로 씻으시면 됩니다. 페놀 무적대식 세포매체에서 세포 펠릿을 ml당 0.2~ 120만 개의 세포농도로 재중단하여 50개의 마이크로리터가 10, 000 ~ 60, 000세포를 함유하도록 한다.
생물학적 안전 캐비닛에서 대식세포 에서 심홍색 형광 세포가 구형 succinimidyl 에스테르 반응성 염료의 용액을 준비합니다. Hoechst 33342를 추가하고 수조에서 작업 용액을 섭씨 37도로 따뜻하게 합니다. 다중 채널 파이펫으로 셀 상류체를 멸균 저장소로 파이프하여 iPSC 대식세포 매체를 부드럽게 흡인시합니다.
다중 채널 파이펫을 사용하여 iPSC 대식세포에 염료 용액의 웰당 70 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다. 페놀 무적대식 세포파지 미디어에서 실험적 치료법을 수리하십시오.
인큐베이션 후, iPSC 대식세포 매체를 다중 채널 파이펫으로 매우 부드럽게 흡인시키고, 우물당 100마이크로리터의 HBSS를 추가한다. 부드러운 파이펫팅으로 HBSS를 즉시 제거합니다. 그런 다음 페놀 무적대식 세포지 미디어 100 마이크로리터와 별도의 우물에 실험 적 치료를 추가합니다.
섭씨 37도에서 10분에서 1시간, 이산화탄소 5%를 배양합니다. 다중 채널 파이펫을 사용하여 액체 의 가장자리에 있는 각 우물의 측면에서 잘 표시된 SH-SY5Y의 50 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3~5시간 동안 배양합니다.
식세포증 이큐베이션 후, 멀티 채널 파이펫으로 파이펫을 사용하여 셀 수퍼나티를 부드럽게 흡인하고 폐기하십시오. PBS 100 마이크로리터로 한 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 2%의 파워 포름알데히드의 100 마이크로리터를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양하여 세포를 수정합니다.
흡인 우물과 PBS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 높은 함량현미경으로 직접 이미징을 진행하거나 플레이트 실러와 호일로 덮어 필요한 때까지 섭씨 4도에 플레이트를 보관하십시오. 고콘텐츠 이미징 현미경을 켜고 이미지 캡처 소프트웨어를 엽니다.
화면 상단의 LOAD"아이콘을 클릭하여 분석 플레이트를 현미경에 로드합니다. 설치"탭을 선택합니다. 왼쪽 상단 상자의 드롭다운 메뉴에서 적절한 플레이트 유형을 선택합니다.
자동 초점 옵션 : 두 피크 "목표 : 40x 물, NA 1.1 "공초점"모드, 1의 비닝. 설정 메뉴를 통해 사용하기 전에 40x 물 목표를 플러시하십시오. 채널 선택 상자에서 플러스 아이콘을 사용하여 채널 DAPI, Alexa 647 및 Alexa 568을 추가합니다.
이를 하나의 마이크로미터의 단일 평면으로 측정하도록 설정합니다. 분석 플레이트의 염색 효율을 위해 시간과 전력 설정을 최적화합니다. 채널을 분리하기 위해 채널 시퀀스를 클릭하여 채널을 동시에 측정하지 않도록 합니다.
탐색 및 레이아웃 정의에서 측정 웰을 선택하고 웰당 9~12개의 필드를 선택합니다. 설정 하는 동안, 플레이트지도에 대표 필드를 클릭 합니다. 그리고 각 측정 채널을 차례로 확인하여 염색이 존재하고 채널 오프셋을 조정하여 이미지가 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
원격 분석을 위해 서버에 데이터를 업로드하려면 온라인 작업"상자와 관련 화면 이름을 클릭합니다. 저장"버튼을 클릭하여 분석 프로토콜을 저장하고 상단에 있는 실행 실험"탭을 클릭합니다. 실험 플레이트의 이름을 지정한 다음 시작을 클릭합니다"라이브 셀 타임 생활 phagocytosis 분석결과 10, 000 SH-SY5Ys, 세포당 파고세포 입자의 수는 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가하고 사이토샬라신 D.에 의해 약 50%에 의해 억제되었고, 잘 당 SH-SY5Y의 양이 더 많으면, phagocytosis는 iPSC의 세분화 불량으로 인해 가난한 선형성을 나타냈다. 더 붐비는 시야에서 대식세포 및 SH-SY5Y.
다음 결과는 식세포증의 대표적인 이미지를 포함하는 고정세포 고함량 이미징을 수행함으로써 얻어졌다. SH-SY5Y의 양을 늘리면 셀당 더 많은 수의 식세포 입자가 발생했습니다. phagocytosis 분석 은 phagocytosis의 몇몇 억제제를 사용하여 검증되었습니다.
사이토샬라신 D와 자스플라키놀라이드는 각각 91% 및 90%씩 식세포증을 현저히 억제했습니다. 그리고 Bafilomycin A1크게 감소 된 phagocytosis 때 1 시간 동안 사전 배양 할 때 phagocytosis 이전 1 시간. 재조합 부속서 5의 첨가는 SH-SY5Y 첨가 직전에 우물에 첨가할 때 교포를 30% 현저히 감소시다.
고정 SH-SY5Ys 우리는 형광 부속서5 프로브를 사용하여 포스파디들세린을 노출하는 것으로 확인되었습니다. 반면 라이브 SH-SY5Ys는 부속서 5 염색에 대해 부정적이었습니다. 1~5시간 의 식세포 증식 지속 시간의 여러 길이는, 파고세포화물의 비틀거리는 첨가를 사용하여 시험되었다.
이 프로토콜의 전체 길이는 식세포화물을 준비하고 iPSC 대식세포를 병렬로 염색하여 단축될 수 있다. 이 작업을 수행하려면 사전에 타이밍을 파악하고 인큐베이션을 사용하여 향후 단계에 대한 솔루션을 준비하십시오.
