Name: neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31501099호)과 중국 후베이성 교육부중장기 및 영(No. 20191104년). 그리고, 우리는 마우스 배아 줄기 세포주 A2lox를 제공하는 우한 과학 기술 대학의 웬성 덩 교수에게 감사드립니다.

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양
<ol><li>0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오.<ol>
<li>멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다.</li>
		<li>세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다. 참고: 젤라틴을 제거한 후에는 코팅된 접시를 말리거나 씻을 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 배아 줄기 세포 (A2lox 및 129) 배양<ol>
<li>인큐베이트 mESC(A2lox 및 129) 세포에서 0.1% 젤라틴 코팅 60 mm 세포 배양 식 에서 mESC 성장 배지에서 37°C에서 각각 5%CO2 인큐베이터에. mESC 성장 매체는 85% 노크 아웃 DMEM/F12, 15% 녹아웃 세럼 교체(KSR), 0.1mM β-메르카토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산 (NEAA), 1 % 페니실린 / 연쇄 상피신 (P / S), 1000 U / mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD032590 (MEK 억제제). 주의: β-메르카토에탄올은 인화성이며 흡입 독성이 있습니다. 화재 원인에서 멀리 하고 사용 시 흡입을 피하기 위해 마스크를 착용하십시오.</li>
		<li>A2lox와 129의 더 나은 성장을 위해 매일 mESC 성장 매체를 변경합니다.</li>
		<li>세포가 80%에 도달하면 배지를 제거하고 접시에 0.1% 트립신1mL을 추가합니다. 모든 셀에 트립신의 커버를 보장하기 위해 부드럽게 30 s에 대한 바위.</li>
		<li>약 1 분 동안 세포를 두고 트립신이활성화한 다음 1 mL 파이펫을 사용하여 트립신을 제거하십시오.</li>
		<li>접시에 mESC 성장 배지 2mL을 추가하고, 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.</li>
		<li>혈종계를 사용하여 현탁액내 의 세포 밀도를 가능한 한 정확하게 계산합니다.</li>
		<li>세포를 7그룹으로 나누고 표 1에표시된 다른 프로토콜을 사용하여 분화를 유도한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MESC에서 NPC로의 차별화 (1단계)
<ol><li>0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 플레이트 또는 커버립을 준비합니다.<ol>
<li>사용하기 전에 1.1 단계에서와 같이 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 커버립을 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 1을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL에 씨를 뿌리고 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 잘 합니다. 현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오.</li>
		<li>부착을 허용하기 위해 6h에 대해 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다.</li>
		<li>부착 후 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS 2 mL로 두 번 씻어 내십시오.</li>
		<li>기초 분화 배지I(표 1)의2mL을 각 웰에 넣고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.</li>
		<li>8 일 동안 분화를 위해 세포를 둡니다. 2일마다 기저 분분 매체 I를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 2를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>1.5 x 106 mESC를 기초 분화 배지 10mL에 첨가하여 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배아 체형성을 허용합니다.</li>
		<li>2 일 후, 15 mL 원심 분리 튜브로 세포 응고를 전송하고 중력에 의해 정착할 수 있습니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 신선한 기초 분화 배지 10mL를 추가하여 배아 체를 재보습합니다. 새로운 미각 세균 성 접시에 그들을 심고 또 다른 2 일 동안 차별화를 허용.</li>
		<li>현미경(도 2A)하에서배아체의 형성을 확인한다.</li>
		<li>단계 2.3.2-2.3.3에 설명된 바와 같이 배아 체를 수집한다. 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.</li>
		<li>1mM 올트랜스 RA 스톡(DMSO)을 준비하고 서브 패키징 후 -80°C 냉동고에 빛으로부터 멀리 보관하십시오. 참고: RA는 불안정하며 RA 재고를 준비하는 동안 빛을 멀리하고 공기 접촉을 줄이는 데 주의를 기울여야 합니다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 또 다른 4일 동안 분화한다.</li>
		<li>2일마다 기초 분화 매체 I(1 μM RA)의 전체 2mL를 변경합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 3을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>식물 1.5 x 106 mESC는 10mL의 기초 분화 배지에서 미적 세균 성 접시에 들어가면 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배아 체 형성을 위해 2 일 동안 둡니다.</li>
		<li>현미경(도 2B)하에서배아체의 형성을 확인한다.</li>
		<li>세포 응집체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 정착하게 합니다.</li>
		<li>상체를 조심스럽게 제거하고 신선한 기초 분화 매체 10 mL을 추가하여 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>약 50개의 배아체를 기초 분화 배지 의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 6일 동안 분화한다. 전체 기저 분분 매체 I(1 μM RA)를 2일마다 변경합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 4를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>부착 후 PBS 2mL로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, 각 우물(작동 농도는 1 μM)에 2 μL의 모든 트랜스 RA 스톡을 추가하여 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다.</li>
		<li>전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 5를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>PBS의 2mL로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>후속 RA 유도의 경우, 각 우물에 2 μL의 RA 스톡을 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 배치하여 또 다른 6일 동안 분화를 유도한다.</li>
		<li>전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 6을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>식물 1.5 x 106 mESC는 배아 체 형성을 허용하기 위해 N2B27 중간 II(표 1)의10 mL에서 미적 세균 성 접시에 들어간다.</li>
		<li>2일째에, 2.3.2-2.3.3 단계에 설명된 바와 같이 세포 응집체를 수집하고 신선한 N2B27 배지 II의 10mL를 사용하여 배아 체를 재연한다.</li>
		<li>새로운 미동세균 접시에 이식하고 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다. 현미경의 밑에 태아 바디의 대형을 확인하십시오.</li>
		<li>4일째되는 날, 배아시체를 수집합니다. N2B27 배지 II의 2mL를 가진 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 당 약 50개의 배아 체를 시드한다.</li>
		<li>모든 트랜스 RA 스톡 2 μL을 각 우물에 넣고 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다. 전체 배지(N2B27 배지 II를 1μM RA로)를 2일마다 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 7을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 이어서, N2B27 배지 II의 2mL를 각 웰에 추가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 8일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>2일마다 전체 N2B27 중간 II를 변경합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 세포 형태 관찰
<ol><li>반전 된 상 대비 빛 현미경에서 매일 위에서 언급 한 7 그룹의 분화 상태를 확인합니다.</li>
	<li>무작위로 최소 12개의 필드를 선택하고 사진을 찍어 D8에서 각 그룹의 형태학적 변화를 기록합니다.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>샘플 준비: 종자 mESC0.1% 젤라틴 코팅 커버립에 2단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 8일 동안 분화를 허용한다.</li>
	<li>린세:8일째에 인큐베이터에서 샘플을 꺼내 포부로 분화 매체를 제거합니다. 부드럽게 5 분 동안 PBS의 1 mL로 한 번 세포를 헹구십시오.</li>
	<li>고정: 각 샘플에 4% 파라포름알데히드 1mL을 추가하고 실온(RT)에서 20분 동안 셀을 수정합니다.</li>
	<li>헹구기: 고정 후, PBS 의 1 mL로 세포를 3번 부드럽게 헹구고, 각각 5분 동안 헹구십시오.</li>
	<li>침투성: PBS에 0.2% TritonX-100의 1mL을 각 샘플에 추가하고 RT에서 8분 동안 둡니다.</li>
	<li>헹구기: 투과화 후, PBS 3회 1mL로 세포를 부드럽게 헹구고 각각 5분간 헹구십시오.</li>
	<li>차단: PBS에 1mL의 염소 세럼을 각 샘플에 추가하고 RT에서 1h에 인큐베이션하여 비특이적 상호 작용을 차단합니다.</li>
	<li>1차 항체를 가진 배양<ol>
<li>PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 1:100의 비율로 항 네스티닌 항체를 희석시.</li>
		<li>희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헹구기: 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>이차 항체를 가진 배양<ol>
<li>PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 알렉사 플루어 488 라벨 염소 안티 마우스 IgG의 비율로 희석 1:500.</li>
		<li>희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 RT에서 2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 참고: 형광 이차 항체를 적용한 후, 형광 담금질을 방지하기 위해 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헹구기: 이차 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>핵 염색 및 장착<ol>
<li>DAPI 마운팅 배지 1방울을 깨끗한 마이크로슬라이드에 놓습니다.</li>
		<li>조심스럽게 플레이트에서 샘플을 꺼내 서 아래로 셀을 가진 DAPI 장착 매체위에 샘플을 배치. RT에서 5 분 동안 어둠 속에서 둡니다.</li>
		<li>흡수성 용지로 과도한 DAPI 마운팅 매체를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 현미경 검사기 관찰<ol>
<li>형광 현미경 검사의 밑에 표본을 놓고 적당한 필터를 사용하여 DAPI와 알렉사 플루올48에 대한 신호를 검출합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대해 10-15개의 서로 다른 시각적 필드를 고르고 무작위로 선택하고 CCD 카메라로 이미지를 기록합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. NPC에서 뉴런으로의 차별화 (단계 II)
<ol><li>가장 높은 차별화 효율을 가지는 단계 2.4에 상세한 프로토콜 3(8일, 표 1)을사용하여 단계 I 분화 하에서 mESC 유도체를 준비합니다(그림 3참조). 참고: 1상 제분화 후, 건강하고 고수율의 NPC를 보장하기 위해 위에서 언급한 세포 형태 관찰 및 면역형광 분석방법을 사용하여 품질 관리를 수행해야 합니다.</li>
	<li>약 5 x 105 mESC 유도체를 기초 분화 배지 의 2mL 내에서 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 뿌려. mESC 유도체를 단계 II 프로토콜 1, 프로토콜 2 및 프로토콜 3로 개별적으로 3그룹으로 임의로 분할합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다. PBS 2mL로 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>기저 분화 매체 I, N2B27 배지 I 및 N2B27 배지II(표 2)의2mL을 각각 위의 그룹의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터에 넣고 10일 동안 차별화할 수 있습니다. 해당 매체를 2일마다 변경합니다.</li>
	<li>분화 상태를 확인하고 3단계에서 언급한 대로 형태학적 변화를 기록합니다.</li>
	<li>18일째에, 뉴런의 생성을 평가하고(β-Tubulin III 양성)을 평가하고 4단계에서 사용하는 3개의 프로토콜의 분화 효율을 결정한다.</li>
</ol>

<ol>
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E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한...

배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경6,공동배양기술7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.
mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>stored at -80 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, and protect from light</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>stored at room temperature</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor human</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids solution</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>stored at -20 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Nonadhesive bacterial dish</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>stored at -80 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>Maintained in feeder-free culture system</td></tr><tr><td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>stored at -20 &amp;deg;C, avoid repeated freezing and thawing</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>stored at 4 &amp;deg;C and protect from light</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 - well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 "2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도" 치?...

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K 조회수.  Wuhan Center for Disease Control and Prevention. 여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

비디오: Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

신경과학

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

생물학

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.