타우 단백질을 자기 조립에서 쌍이 있는 망막 필라멘트로 잘못 접는 것은 알츠하이머 병 및 기타 타우오병증의 병리학적 특징입니다. 여기서 우리는 타우 병발생 과정을 해명하는 데 도움이 될 수 있는 강력한 타우 응집 분석서를 제시합니다. 변환은 핵 의존성 중합 공정의 모든 단계를 따르며 매우 재현 가능하여 현재까지 OBSI 수준을 충족한 보다 엄격한 형식으로 약물 스크리닝을 허용합니다.
시약의 품질은 매우 중요합니다. 재조합 타우는 매우 순수하고 골재와 조각이 없어야합니다. 먼저 컴퓨터와 멀티 모드 마이크로 플레이트 판독기를 켭니다.
장비가 안정화될 수 있도록 허용한 후 소프트웨어를 시작하고 표준 프로토콜을 프로토콜 유형으로 선택합니다. 온도를 섭씨 37도로 설정하고 프로토콜을 계속하기 전에 예열을 선택합니다. 다음으로 운동 런타임을 50시간으로 설정하고 측정 간격을 15분으로 설정합니다.
연속 모드에서 분당 425 사이클로 궤도 흔들림을 설정합니다. 이에 따라, 형광 강도 의 종점 운동 모모크로미터로 읽기 방법을 선택합니다. 내분 파장을 440 나노미터로 설정하고 방출 파장을 485 나노미터로 설정하고, 광학 위치는 상부로, 80으로 게인한다.
일반 읽기 속도를 선택하고 읽기 높이를 4.50밀리미터로 설정합니다. 그런 다음 프로토콜의 유효성을 검사하고 저장합니다. 생성된 프로토콜을 사용하여 실행을 시작합니다.
실험의 이름을 지정하고 새로 만든 파일의 대상을 선택하고 계측기를 원하는 온도에 미리 평가할 수 있도록 합니다. 자발적인 재조합 타우 변환 실험을 위해, 1,000 마이크로리터 반응 샘플을 티오플라빈-T 형광을 위한 800 마이크로리터, 1.5 밀리리터 튜브에서 반응 버퍼와 단백질을 먼저 혼합하여 SEC-MALS 분석을 위한 130 마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 헤파린과 티오플라빈-T를 넣고 5번 위아래로 피펫을 하여 잘 섞습니다.
높은 재현성을 보장하고 시약을 동일한 순서로 혼합하고 기간 내에 유지하려면 프로토콜을 정확하게 실행하는 것이 중요합니다. 시료를 12, 000 x g 및 섭씨 25도에서 5분간 회전하여 기포를 제거합니다. 원심분리에 따라 96웰 마이크로플레이트에서 잘 반응 시료 200마이크로리터를 분배하여 기포형성을 피한다.
그런 다음 증발을 피하기 위해 마이크로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로 플레이트를 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기에 배치합니다. 전체 플레이트를 선택하거나 플레이트가 가득 차 있지 않은 경우 읽을 우물을 선택하고 측정을 시작합니다.
데이터를 데이터 처리 소프트웨어로 내보냅니다. 그런 다음 장비에서 마이크로 플레이트를 제거합니다. 다음으로 마이크로 플레이트에서 실러를 제거합니다.
응집된 샘플을 두 번 위아래로 파이프팅하여 우물에 혼합하고 1.5 밀리리터 튜브에 서로 다른 복제를 풀로 넣습니다. 각 샘플을 5회 위아래로 파이프팅하여 철저히 섞고, 원자력 현미경으로 골재를 분석하기 위해 공수 표면에 10~20마이크로리터를 분배합니다. 이에 따라 1시간 동안 1.5밀리리터 튜브를 20, 000 x g, 섭씨 4도에서 회전하여 골재를 수확합니다.
SEC-MALS의 상체를 분석하여 샘플에 단백조 타우가 없는지 확인하여 골재로 성공적으로 변환되었음을 나타냅니다. 다음으로, 남은 모든 상체를 제거하고 초기 재조합 타우 단백질 농도 및 시료 부피와 함께 나머지 골체를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 라벨을 부착한다. 스냅은 골재를 동결하고 섭씨 80도에서 보관합니다.
시드 실험의 경우, 냉동실에서 재조합 타우 응집체를 제거하고 라벨에 표시된 반응 버퍼의 부피를 추가하고 튜브가 실온으로 안정화되도록 합니다. 그런 다음 5~8회 위아래로 피펫팅하여 응집체를 다시 일시 중지합니다. 총 1/8 인치 마이크로 팁을 사용하여 얼음에 200 마이크로리터 골거된 샘플을 초음파 처리하여 1초 의 펄스를 30% 진폭으로 2초 가량 제거합니다.
다음으로, 1.5 밀리리터 튜브에서 단백질과 반응 버퍼를 먼저 혼합하여 800 마이크로리터 반응 샘플을 준비한다. 그런 다음 헤파린과 티오플라빈-T를 넣고 5번 위아래로 피펫을 하여 잘 섞습니다. 시료를 12, 000 x g 및 섭씨 25도에서 5분간 회전하여 기포를 제거합니다.
원심분리에 따라, 기포의 형성을 피하고, 96웰 마이크로 플레이트에서 잘 당 반응 샘플의 198 마이크로리터를 분배. 미리 형성된 피브랄 샘플을 세 번 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다. 각 우물에 원하는 씨앗 비율에 해당하는 양을 추가하고 세 번 위아래로 파이펫을 하여 혼합합니다.
그런 다음 증발을 피하기 위해 마이크로 플레이트를 밀봉하십시오. 마이크로 플레이트를 다중 모드 마이크로 플레이트 판독기에 놓고 측정을 시작합니다. 실험이 완료되면 장비에서 마이크로 플레이트를 제거합니다.
그런 다음 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. C291A 및 C322A 돌연변이및 n 단자 c 단자가 함유하는 재조합 타우는 SDS 페이지에 시각화된 바와 같이 매우 순수하며 SEC-MALS가 평가한 거의 100% 단백성입니다. 헤파린 유도 재조합 타우 응집은 440 나노미터의 내분 파장 과 485 나노미터의 방출 파장을 사용하여 티오플라빈-T 형광을 따랐다.
분석은 10 개의 개별 우물에서 나온 결과와 거의 구별 할 수없는 것으로 매우 재현 할 수 있습니다. 재조합 타우 골재는 보고된 전 생체 내 형태와 유사한 서로 다른 길이의 피질적 구조의 균일한 혼합물이다. 최종 반응 혼합물은 단조를 포함하지 않으며 SEC-MALS 측정에 의해 표시된 바와 같이 골재로의 전체 변환을 제안합니다.
독립적 인 실험 실행에서 재조합 타우 응집의 운동은 유사한 시그모이드 곡선과 구별 할 수없는 지연 및 성장 단계에 의해 강조와 유사합니다. 단백질의 다른 배치가 사용될 때 재현성의 높은 수준은 유지됩니다. 사전 형성된 재조합 타우 골재는 타우 단량체 를 모집하고 드 노보 타우 골재의 형성을 유도하는 데 효율적이며, 공정의 효율성은 종자의 비율과 직접적으로 비례한다.
부피로 발현된 타우 응집체의 0.0025%의 양은 재조합 타우 핵을 우회하고 드 노보 피브랄 생성을 유발할 수 있다. 현재 분석은 타우의 생체 내 잘못된 접기 및 집계로 여겨지는 것을 모방하고 병인 과정에 빛을 비추고 약물의 다른 단계를 가진 약물 후보의 간섭을 연구하기위한 귀중한 도구를 구성 할 수있는 기계론적 연구를 가능하게합니다. 분석의 높은 재현성은 과학자들이 실험실에서 상대적으로 쉽게 구현 할 수 있습니다.
현재 분석은 가장 긴 타우 동소형태인 인간 타우-441에만 초점을 맞추고 있지만, 응용 프로그램은 다른 타우 변종을 연구하도록 조정할 수 있다. 그리고 잊지 마세요, 올바른 단백질 시약을 선택하고 높은 품질의 표준에서 생산하는 것은 강력하고 매우 재현 가능한 분석체를 설정하는 데 필수적이다.
