엑소시토시스 소프트웨어의 자동 검출 및 분석을 통해 사용자는 pH 에 민감한 형광의 외세포 이벤트 및 TIRF 이미지 시퀀스를 자동으로 감지할 수 있습니다. 또한 공간 분포 나 주파수와 같은 외세포증의 특징뿐만 아니라 반감기 또는 배경에 따른 형광 변화와 같은 외세포 이벤트의 개별 특성을 자동으로 출력합니다. 또한, 이전에 문학에 설명된 외세포증의 네 가지 모드로 외세포 이벤트를 분류하는 옵션이 포함되어 있습니다.
Exocytosis 소프트웨어의 자동 감지 및 분석을 사용하기 위해 먼저 데이터 집합 찾기 버튼을 클릭하고 데이터가 증착된 곳으로 이동하면 원시 데이터라는 폴더에 넣으십시오. 데이터 파일은 여기에서 목록을 자동으로 채우고 이 폴더에 데이터 파일 수를 가질 수 있습니다. 다음으로 분석 파일이 입금되는 디렉토리를 선택해야 합니다.
여기서 테스트라는 디렉토리를 선택했습니다. 픽셀 크기뿐만 아니라 이미지의 프레임 속도를 입력해야 합니다. 여기에 내 프레임 속도는 프레임 당 백 밀리초, 내 픽셀 크기는 8 나노 미터입니다.
마지막으로, 엑소시토시스 소프트웨어의 자동 탐지 및 분석을 실행하려면 마스크 파일이 필요합니다. 포함된 마스크 메이커 버튼을 사용하여 데이터 파일에서 마스크 파일을 자동으로 생성할 수 있습니다. 실행 표시기가 노란색으로 바뀌고 마스크 메이커가 실행이 완료되면 녹색으로 돌아갑니다.
마스크는 선택한 디렉터리에서 마스크 파일이라는 새 폴더에 보관됩니다. 그리고 마스크 파일은 자동으로 여기에 목록을 채웁니다. 마스크 파일이 데이터 파일에 맞게 이루어지고 있는지 확인하고 목록의 데이터 파일과 해당 마스크 파일을 강조 표시하여 이 작업을 수행할 수 있습니다.
데이터 파일의 첫 번째 프레임이 표시되고 선택한 마스크 파일도 표시됩니다. 여기. 우리는 우리의 마스크 파일이 손에 분석에 적합한 것을 볼 수 있습니다. 마스크 파일은 사용자가 별도로 제공할 수도 있습니다.
현재 데이터 파일에서 마스크 파일을 만들고자 하는 경우 이미지 J.In 순서를 사용하여 마스크 파일을 만들려는 이미지 J에서 먼저 이미지를 엽니다. 그런 다음 다각형 선택 도구를 사용하여 셀 가장자리를 클릭하여 마스크 파일 만들기를 시작할 수 있습니다. 마스크를 완료한 경우 전체 다각형에 연결하려면 두 번 클릭합니다.
이 작업이 완료되면 편집, 선택 및 마스크 만들기로 향합니다. 반전된 마스크가 만들어집니다. 데이터 파일과 동일한 이름을 사용하여 이 마스크 파일을 저장한 다음 _mask_file 저장하려고 합니다.
이제 사용자 지정 마스크 파일을 제공하는 경우 자동 검색 소프트웨어에 해당 마스크 파일이 있는 위치를 알려주는 것이 중요합니다. 이렇게 하려면 마스크 파일 찾기 버튼을 클릭하고 마스크 파일이 있는 디렉토리로 이동합니다. 그런 다음 새 마스크 파일이 목록을 여기에 채웁니다.
분석을 실행하기 전에 모든 단일 데이터 파일에 대한 마스크가 있어야 합니다. 이제 데이터 집합이 로드되고 마스크 파일, 프레임 속도 및 픽셀 크기가 올바르게 조정되고 선택한 디렉터리가 완료되면 마지막으로 분석의 일부로 분류를 포함할지 여부를 결정할 수 있습니다. 분류 버튼을 전환하면 외식 이벤트를 감지하는 것 외에도 각 외식 이벤트는 4개 클래스 중 하나로 분류됩니다.
분석 실행 방법을 결정한 후 분석 단추를 클릭하여 분석을 시작할 수 있습니다. 실행 표시기는 노란색으로 전환되어 분석이 진행 중임을 나타내고 분석이 완료되면 녹색으로 돌아갑니다. 분석이 완료되면 실행 표시기에서 노란색에서 녹색으로 변경되는 대로 선택한 디렉터리 내에 새 데이터 파일 폴더가 나타났습니다.
데이터 파일 폴더 내에서 분석 실행의 각 이미지에 해당하는 분석 파일을 찾을 수 있습니다. 또한, 각 이미지 세트에 대한 외세포증의 빈도와 같은 요약 정보를 포함하는 셀 통계 파일이 여기에 있다. 각 이미지 집합에 대해 X 위치, Y 위치 및 외식 이벤트가 발생하는 위치에 대한 프레임 번호에 대한 정보가 포함된 형광 추적 파일이 있습니다.
또한, 각 외세포 이벤트 주변의 관심 영역의 평균 형광은 외세포증 전, 도중 및 이후에 모두 제시된다. 또한 X, Y 및 측두식 위치의 유사한 정보를 포함하는 추적 파일도 있습니다. 그러나 분류 확인란을 선택하면 4개의 클래스 중 하나에 속하는 외식 이벤트의 가능성을 나타내는 4개의 추가 열이 있습니다.
전체 소포 퓨전 순간, 전체 소포 융합 지연, 키스 앤 런 순간, 또는 키스 앤 런 지연. 외세포 이벤트는 0.5보다 크고 관제된 4개 클래스 중 가장 높은 확률인 경우 4개 클래스 중 하나에 속합니다. 이 경우, 여기서 첫 번째 외식 이벤트는 전체 소포 융합 인스턴트 클래스에 속하며, 이는 4개 클래스보다 높은 수이며 0.5보다 크다.
또한, 각 이미지 세트에 대한 다른 피쳐 파일이 많이 있는데, 이는 외세포증의 분류 중에 사용되며 추가 분석을 위해 관심을 가질 수 있다. 마지막으로, 외세포증의 공간 적 정수 조직을 감지하기 위해 Ripley의 K 분석을 사용하려면 먼저 마스크 파일을 중성염 마스크 파일과 소마 마스크 파일로 분할하여 시작합니다. 이미지 J.We에서 마스크를 먼저 열어 백그라운드 픽셀을 선택하려면 색상 피커를 사용하려고 합니다.
그리고 이런 식으로 마스크 파일을 채울 때 올바른 값입니다. 다음으로 다각형 선택 도구를 사용하고 체세포 영역을 간략하게 설명합니다. 이제 이 작업을 위해서는 약간의 주관적인 수동 의사 결정이 필요합니다.
우리는 거친 타원을 제안합니다. 완료되면 편집, 선택 및 마스크 만들기로 이동합니다. 마지막으로, 원래 마스크 파일로 돌아와 편집하고 채우기를 사용하여 소마를 채우고, 이제 별도의 neurite 및 soma 마스크 파일을 가지고 있습니다.
당신이 당신의 별도의 neurite 및 소마 마스크 파일을 저장한 후, 여기에, 나는 마스크 파일이 neurite에 대한 neur를 강조하고 소마를 강조로, 우리는 MATLAB에 와서 neurite 2D 네트워크 MATLAB 파일을 엽니 다. 여기에서 현재 폴더를 탐색하여 모든 분석 데이터를 증착한 디렉터리로 이동합니다. 일단 우리가 그것을 완료 하면, 우리는 다음 우리의 새로운 마스크 파일의 마스크 이름 경로 변경 됩니다., neurite.
그래서이 경우, 나는 마스크 파일 폴더 아래에 내 neurite 마스크 파일이 있습니다. 그런 다음 CSV 파일 이름을 형광 추적 파일이 있는 곳으로 변경합니다. 이 경우 데이터 파일 폴더에 남아 있으므로 데이터 파일이 슬래시되고 형광 추적 CSV 파일의 이름이 있습니다.
완료되면 실행을 실행할 수 있습니다. 그러면 neurite 마스크 파일의 골격 버전을 만들고 마스크 파일 폴더 아래에 CSV 파일로 입금하여 여기에서 볼 수 있습니다. 다음으로 소마에 대한 CSV 파일도 생성합니다.
이렇게 하려면 CSV 마스크 작성자 파일을 엽니다. 소마 마스크의 경로와 CSV 파일을 만들 이름을 입력할 수 있습니다. 여기 그냥 가서 바로 점 CSV추가와 같은 정확한 파일 이름을 사용했다.
실행중이며, 뉴라이트와 함께 새 소마 CSV 파일이 생성되었음을 알 수 있습니다. 중성염 마스크와 소마 마스크 모두에 대한 CSV 파일을 만든 후에는 Ripley의 K 분석을 실행할 수 있습니다. 이렇게 하려면 R Studio로 이동하여 Ripley의 K 분석 R 파일을 엽니다.
신경 마스크와 뉴런 데이터 포인트에 주의를 기울이기 위해 여기에 두 가지 주요 변수가 있습니다. 뉴런 마스크는 실행하려는 마스크 파일을 가리킵니다. 이 경우 먼저 소마 마스크 파일을 실행하고 있습니다.
모든 neurite 마스크 파일과 별도로 모든 소마 마스크 파일을 실행하려고 합니다. 여기, 나는이 분석을 위해 사용할 두 개의 뉴런이 있습니다. 그러나 Ripley의 K 분석에 원하는 만큼 사용할 수 있으므로 이 코드를 복사하여 붙여 넣은 다음 뉴런 마스크에 대한 코드를 복사하여 붙여넣기하고 변수를 3으로 변경하고 그 이후로 변경하면 됩니다.
두 번째 변수는 뉴런 데이터 포인트입니다. 여기에서 모든 추출된 R 파일을 피처에 의해 생성된 파일을 가리키려고 합니다. 이제 내 퓨전 통계라는 이름이 붙여졌으며, 이것이 여기에서 읽는 것입니다.
언급 했듯이, 나는 우리가 함께 리플리의 K를 집계 할 수 있도록 함께 분석되고있는 두 번째 소마 마스크 파일과 뉴런이 있습니다. 이러한 경로를 올바른 경로로 변경한 후 코드를 사용하고 지역을 실행하고 모두 실행합니다. 실행이 완료되면 그룹화된 Ripley의 K 값과 밀도 플롯을 포함하여 여러 플롯이 생성됩니다.
이러한 검색은 내보내기, 이미지 저장 및 적절한 이미지 형식, 디렉터리, 파일 이름 및 마지막으로 저장을 누르면 저장할 수 있습니다. 여기에서 우리는 TIRF 현미경 을 사용하여 체외에서 이틀에 심상광을 발현하는 12 murine 피질 뉴런에서 대표적인 결과를 봅니까. A에서는, 우리는 클래스로 분할 된 외세포증의 주파수를 참조하십시오.
여기서 우리는 전체 소포 융합 즉시 다른 클래스보다 더 자주 발생하는 것을 볼 수 있습니다. B에서는 모드 분포를 볼 수 있어 전체 소포 융합이 모든 이벤트의 절반 이상을 차지한다는 것을 확인할 수 있습니다. C에서는 열맵으로서 외세포증의 공간 분포를 결정합니다.
우리는 외식 사건의 대부분이 소마 근처의 핫스팟뿐만 아니라 중성염의 단부 끝에 클러스터되어 있음을 알 수 있습니다. D에서 우리는 외세포 사건이 통계적으로 현저하게 클러스터되고, 이 클러스터의 크기가 반 미크론에서 1개의 미크론 크기에 구역이 있다는 것을 결정할 수 있습니다. 자동화된 분석 프로그램을 사용하여 편견없는 방식으로 외세포 이벤트를 올바르게 식별하고 분석하면 분석 효율성이 향상되고 재현성과 엄격함이 향상됩니다.
검출의 정확성을 보장하기 위해 이미징 중에 소음에 대한 높은 신호를 유지하는 것이 중요합니다. 외세포 이벤트 또는 기타 pH 에 민감한 일시적인 이벤트를 캡처하려면 모든 이벤트를 캡처하고 반감기 또는 형광의 피크 변화와 같은 추정을 개선할 수 있을 만큼 빠르게 이미징 주파수가 필요합니다. 우리는 이 프로그램이 뉴런 개발에서 pH에 민감한 형광을 정확하게 포착하기 위한 것이 아니라 다른 세포 유형도 효과가 있음을 입증했습니다.
그러나 다른 세포 유형을 사용하는 경우 다른 세포 유형의 일시적인 이벤트의 뚜렷한 동작으로 인해 정확도의 차이를 확인하는 것이 중요합니다. 이 분류는 현재까지 뉴런 개발에만 사용되었습니다. 그리고 실제로 우리는 이 프로세스가 그밖 세포 모형또는 뉴런에 있는 나중에 발달 시간 점에 존재한다는 것을 모릅니다.
