이 연구는 과학 및 기술 위원회 상하이 (보조금 번호 14411961800)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81300805)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서 <ol><li>문화 및 세포 주기 동기화 셀.
	<ol><li>유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 &#39; s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO 2 보충.</li>
		<li>G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다.
		<li>HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 7 셀을 사용 하 여 치료 전에 24 h에 대 한 25 ml 성장 매체와 접시 수 <ol>. 70%-80%, aspirate의 합류에 도달 세척 매체 후 셀 두 번 5 mL와 함께 prewarmed 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).</li>
			<li>추가 25 mL 1% 포함 된 DMEM 페니실린-스와 72 h. 씻어 3 mL 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 접시에서 셀에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. 새로운 5 mL 튜브로 셀 전송.</li>
			<li>Cytometry (1.2 단계)에 의해 세포 주기 분석에 셀의 작은 부분을 주제; 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리 하 여 셀의 나머지 대부분을 수집 하 고 분석까지 울트라-낮은 온도 냉동 고에 저장 하 Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>G1 단계를 셀, G0 동기화 프로세스의 끝에는 DMEM를 제거 하 고 다시 신선한 성장 매체, 세포 주기를 재입력 하 HEK293 세포 되므로 추가. 그런 다음, 다른 g 1 단계에서 세포를 수집 (초기 g 1: 30 분; G1: 2 h) 세포 주기 분석 및 추가 스모 시험.</li>
		<li>더블 티 미 딘 블록 메서드를 사용 하 여 S 단계에서 HEK293 세포를 동기화 합니다.
		<li>성장 HEK293 세포 50% 및 세척의 confluency <ol>prewarmed PBS 가진 셀입니다. 2.5 m m 티 미 딘 18 h (첫 번째 블록)에 대 한 보충 성장 매체를 추가 합니다.</li>
			<li>티 미 딘을 포함 하는 매체를 제거 하 고 셀 prewarmed PBS로 두번 세척. 14 h 셀 출시를 위한 신선한 성장 매체 추가.</li>
			<li>는 피 펫과 매체를 삭제 하 고 2.5 m m 티 미 딘 다른 18 h (2 블록)에 대 한 보충 성장 매체는 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 추가.</li>
		</ol></li> <li>G 2은 / M에 대 한 동기화, 25 mL 24 h에 대 한 성장 매체와 15cm 접시 접시 ~1.5 × 10 7 HEK293 세포. 다음 400 ng/mL의 최종 농도 얻을 때까지 매체에 nocodazole을 추가 합니다. 마지막으로, 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 16 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol></li> <li>Cytometry에 의해 세포 주기 분석.
	<ol><li>다시 PBS에 동기화 HEK293를 일시 중단 하 고 다음 2 h 4에서 차가운 70% 에탄올을 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 수정 ° C. 셀 클러스터링 최소화, 세포 현 탁 액의 최종 농도를 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올 dropwise 추가할 유의 부드럽게 vortexing 동안 70% 에탄올.</li>
		<li>X 500g에 5 분에 대 한 셀을 원심 다음 신중 하 게 하 게 삭제는 상쾌한 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어. 원심 분리기 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>추가 500 µ L PBS 포함 50 µ g/mL 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물, 셀에 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 1 µ g/mL RNase A와 섞어 잘. 15 분 37에 대 한 셀을 품 어 ° c.</li>
		<li>Cytometry 분석까지 4 ° C에서 샘플 저장.</li>
	</ol></li> <li>생 Rb 단백질의 Immunoprecipitation.
	<ol><li>준비는 HEK293 세포 lysates입니다.
		<ol><li>Lyse 부드럽게 다시 차가운 라디오-immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (표 1)의 1 mL에 갓 포함 하는 그들을 중단 하 여 동기화 HEK293 세포 추가 20 mM N-Ethylmaleimide, 수 있는 isopeptidase 억제제 스모 프로 테아 제를 차단 하 고 안정화 스모 어원이 같은 말.</li>
			<li>더 균질 Dounce 균질, 쥡니다 또는 단순히 통과 10 배 2 mL 주사기에 21 G 바늘을 통해 얼음에 셀. 그런 다음, 5 분 ice에 셀을 품 어 
			참고: 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) RIPA 버퍼에는 Rb 스모의 최신 결정에 대 한 중요 한으로 Rb 단백질 및 기타 비 공유 상호작용에서 파생 된 불특정 스모 신호를 제거할 수 있습니다. 비-Rb 스모 종.</li>
		</ol></li> <li>4 시 30 분에 대 한 18000 x g에서 세포 lysates 원심 ° C. 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 튜브는 supernatants 전송. 
		참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 단백질-80 ° C에 6 개월 이상 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비 하 저장 위의 설명 상쾌한의 작은 부분 새로운 튜브와 스토어-80 ° c.</li>
		<li>위의 supernatants Rb 항 체 단일 클로 널 및 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 20 µ L 1 µ g의 일반적인 마우스 면역 글로불린 G (IgG) 같은 종과 isotype의 추가. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>원심 3 분 3000 x g에서 샘플 4 ° C. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송. 각 샘플에 5 µ L Rb 1 차적인 항 체와 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 40 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
		<li>4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 비드 손실을 방지 하기 위해 유의 구슬 드라이 발음 하지 않습니다.</li>
		<li>씻어 4 번 RIPA 버퍼의 1 mL와 구슬. 각각, 혼합 튜브 15 분에 4 ° C에서 수집 하는 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 낮은 속도 원심 분리에 의해 시간과 다음 삭제는 supernatants.</li>
		<li>Supernatants 최종 세척에서 제거 후 다시 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 로드 버퍼 (표 1) x 30 µ L 1에에서 비즈를 일시 중단 하 고 잘 혼합.
		<ol><li>품 튜브는 열에 100 ° C에서 10 분 원심 작은 구슬에 1 분 동안 12000 x g에서 샘플에 대 한 차단. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송.</li>
		</ol></li> <li>샘플 4%-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤 분석 및 서양 오 점 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 인간 세포에 외 인 Rb SUMOylation 6XHis 태그의 분석 <ol><li>세포 문화 및 transfection.
	<ol><li>씨 ~ 6 × 10 6 HEK293 세포 10 cm에 요리 하 고 75%-85 %confluent 셀을 얻으려고 정상 세포 문화 조건 하에서 성장 매체에 24 h에 대 한 품 어. Transfection, 전에 성장 매체를 제거 하 고 prewarmed 감소 된 혈 청 매체의 6 mL을 추가 (재료의 표 참조) 하 고 다음 요리 다시 인큐베이터.</li>
		<li>Rb에 대 한 제정 SUMOylation 분석 결과, 각각 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 500 µ L 감소 된 혈 청 매체에 15 µ g 각 6XHis 태그 Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT 및 Ubc9 C93S 플라스 미드의 추가.
		<ol><li>야생 타입 Rb의 스모 활용 및 그것의 SUMOylation 결함 돌연변이 분석, 10 µ g 어느 6XHis 태그 Rb-WT 또는 Rb K720R 플라스 미드 GFP SUMO1와의 혼합 (10 µ g) 500 µ L 감소 1.5 mL 마이크로 원심 분리기에서 혈 청 매체 13 관.</li>
		</ol></li> <li>한편, 별도 튜브에서 50 µ L transfection 시 약을 혼합 500 µ L 감소, 혈 청 매체 (재료의 표 참조) 및 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>완벽 하 게, 위에서 설명한 두 개의 별도 튜브를 결합 하 여 세포 시 약/플라스 미드 단지 15 분 추가 transfection에 대 한 실 온에서 품 어 고 8에 대 한 문화를 계속 5% CO 2와 37 ° C에서 h</li>
		<li>Transfection 후 48 h에 대 한 정상적인 문화 조건 하에서 세포를 품 어 고 성장 매체, 감소 된 혈 청 매체.</li>
	</ol></li> <li>선호도 풀 다운 6XHis 태그 Rb 단백질의 니켈.
	<ol><li>Transfected HEK293 세포를 lyse 고 설명된 섹션 1.3.1로 총 단백질 추출.</li>
		<li>원심 분리기는 세포 lysates 18000 x g에서 4 시 30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 깨끗 한 튜브에 그들을 전송. 
		참고: 단백질 얼 수 있다이 시점에서 6 개월 이상-80 ° c.</li>
		<li>나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비, 새로운 관을-80에 게 위에서 설명한 supernatants의 작은 부분 저장 ° c.</li>
		<li>워시 25 µ L 50%의 니켈 각 샘플에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 두 번 RIPA 버퍼 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) agarose 구슬. 4 시 3 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 ° c.</li>
		<li>10 m m의 최종 농도 얻기 위해 각 샘플에 추가 1 M 이미. 그런 다음 준비 된 Ni NTA agarose 구슬 포함 된 튜브에 각 샘플 추가.</li>
		<li>구슬과 부드러운 회전 4 ° C에서 2 h lysates 품 어. 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 구슬 회전 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 supernatants를 제거 합니다. 손실을 방지 하기 위해 구슬, 구슬 드라이 발음 하지 마십시오.</li>
		<li>이미 20 m m (표 1)를 포함 하는 워시 버퍼의 1 mL와 구슬 세척. 각 시간, 혼합 튜브 15 분 수집 4 ° C에서 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 회전 및 삭제는 supernatants.</li>
		<li>최종 세척 후 각 샘플을 차입의 30 µ L 버퍼 포함 250 m m 이미 (표 1)를 추가 하 고 혼합 영화. 그런 다음, 단백질을 elute 하 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>혼합 각 샘플 6 × SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1). 그런 다음, 10 분에 대 한 열 블록에 100 ° C에서 튜브를 품 어</li>
		<li>원심 분리기에서 12000 x g 작은 구슬 1 분. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 ml 마이크로 원심 관에 샘플을 전송. 샘플을 서쪽 오 점 분석 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 3. 서쪽 오 점 <ol><li>로드는 immunoprecipitation 또는 풀 다운 4-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤에 이전 단계에서 얻은 샘플. 단백질 분리를 90 분 동안 120 V에서 전기 이동 법 실시.</li>
	<li>전송 단백질 젤에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 300에서 electroblotting에 의해 탱크 전송 방법을 사용 하 여 4 ° C에서 90 분 동안 mA. 5%의 저지방 우유 (표 1) 실 온에서 1 h를 포함 하는 블록 버퍼에 PVDF 막 차단.</li>
	<li>품 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1)를 포함 하는 항 체 희석 버퍼에 1 차 항 체로 막 4 ° c.에서 하룻밤 1 차 항 체에 대 한 작동 농도 0.5 µ g/mL (안티-SUMO1 항 체), 또는 1: 2000 (안티-Rb 및 안티 Tubulin 항 체), 또는 1:5,000 (안티-GFP와 반대로 그의 항 체)의 희석 사용.</li>
	<li>씻고 막 3 x 10 분 트윈 (TBST) 버퍼 (표 1) tris 버퍼 염 분 x 1을 사용 하 여 각 시간에 대 한. 5% 탈지 우유 (표 1)를 포함 하는 블록 버퍼에 종 특정 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용 된 이차 항 체 희석된 1:5,000와 막 품 어. 3 막 씻고 10 분 1 x TBST 버퍼를 사용 하 여 각 시간에 대 한 x.</li>
	<li>는 솔루션 작업 향상 된 화학 (ECL)와 막 품 어. 커버 플라스틱 포장을 가진 막 및 신호 강도 따라 x 선 필름에 노출.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.
이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 의해 부호화)으로 구성, 모든 스모 종은 훨씬 풍부한; 2) 대부분의 스모 대상 단백질에 대 한 스모 활용에 관련 된 효소 사이 지속적인 경쟁의 결과 이며14,21; deconjugation는 안정 된 상태에서 SUMOylated는 주어진된 단백질의 단지 작은 부분 그리고 3) 스모 목표 SUMOylation 및 deSUMOylation의 급속 한 주기를 받을 수 있습니다. 예를 들어 현재이 논문의 저자에 의해 얻은 최근 데이터 Rb SUMO1 SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정13는 개념와 일치 초기 g 1 단계에서 시간이 매우 짧은 창에 대해서만 존재 입증 . 이러한 모든 사실을 직접 주어진된 단백질의 생 SUMOylation 감지를 도전 합니다. 따라서, 성공적으로이 감지,이 수정이 발생 하는 정확한 조건을 식별 하기 위해 생명 이다. 예를 들어,이 제안 된 프로토콜에서 세포 주기 동기화의 타이밍은 Rb SUMOylation의 검출에 대 한 중요 합니다. 최적화 된 실험 절차 또한 주어진된 단백질의 낮은 수준의 스모 수정 종의 성공적인 탐지를 위해 중요 하다. 예를 들어 적절 한 쥡니다 또는 바늘 통과 통해 끈 적 하 고 점성 구성 요소 때문에 genomic DNA의 형성을 막을 수, 따라서 적절 한 쥡니다 총 단백질 추출을 촉진할 수 있다. 또한, 대상 단백질에 높은 선호도와 좋은 단일 클론 항 체 수량 및 immunoprecipitation의 특이성을 향상 도움이 될 수 있습니다. 요약, 제안된 된 방법에서는 더는 내 생 Rb 이다 SUMOylated, 다음 overexpression 기반 기능 분석 결과의 전제 생리 조건 탐험을 위한 중요 한입니다.
주어진된 단백질의 스모 신호 증폭, 공동-overexpress 다른 스모 관련 단백질 (일반적으로 Ubc9와 스모 단백질) 셀에 뿐만 아니라이 단백질에 일반적입니다. 기판에 대 한 항 체를 사용 하 여 간단한 서쪽 오 점 높은 분자량,이 단백질의 SUMOylated 형태로 찾을 수 있는 쉬운 방법 이지만, 우리는이 방법으로 스모-Rb 신호를 감지 하지 못했습니다. 따라서,이 종이 침전 된 외 인 Rb 단백질의 SUMO 수정 감지 하는 방법에만 집중. 또한,이 방법은 인위적으로 향상 또는 Rb의 스모 활용을 제거 하는 방법을 설명 합니다. 유일한 E2 리가로 Ubc9 직접 특정 대상22에 스모를 전송 발견 되었습니다. 따라서, Rb의 C 맨끝에 융합 하 여 Ubc9 크게 촉진 Rb.이 방법을 사용 하 여 스모 수정,이 종이의 저자 성공적으로 시연는 Rb SUMOylation 충분히 추진 자체 인 산화 증가 하는 그것의 바인딩 CDK213 또한, Rb SUMOylation의 손실의 기능적 결과 공부, 저자 이전에 보고 된11로 스모 불충분 한 Rb 구문 생성. 현재이 문서에 제안 된 메서드를 사용 하 여 스모-Rb는 정상적인 세포 주기 진행 및 셀 확산13필요한 보였다.
SUMO1, 외 SUMO2 및 SUMO3 또한 중요 한 역할에서에서 재생할 단백질 SUMOylation14,17. SUMO2와 SUMO3는 종종 라고 합니다 SUMO2/3 그들은 밀접 하 게 관련 되어 있기 때문에 97% 정체성을 공유. SUMO1은 SUMO2/3와 50%의 유사성을 공유 한다. 그것은 널리 허용 스모-2/3는 주로 셀 스트레스 응답15,,1723, 에 참여 하는 반면 SUMO1 정상 세포 생리 기능 및 유지 관리에 대 한 책임은 24. Rb 수 SUMO2/3 SUMOylated 알 수 없는 함수12, 그에 주어진이 연구에서 제안 된 방법은 여전히 검색 및 Rb의이 수정이의 분석에 적합. Rb, 뿐만 아니라 여기에 설명 된 방법은 널리 검색 및 다양 한 표적 단백질의 SUMOylation의 기능 분석에 적용할 수 있습니다.

진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암5의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.
포스트 번역 상 수정 RB 함수8,9의 규칙에 있는 중추적인 역할을 한다. 인 산화는 같은 한 수정, 그리고 그것은 일반적으로 Rb 비활성화 리드. 무부하 G0 셀에 Rb 인 산화 낮은 수준으로 활성화 됩니다. G0/G1 단계 진행 세포, Rb는 순차적으로 하이퍼-phosphorylated  종속 단백질 kinases (CDKs) 및 Rb를 비활성화 하 고 세포 주기를 억 누르기 위해 능력 제거   및 E/CDK2 D/CDK4/6, 같은 cyclins, 일련의에 의해 관련 유전자 식4,10. Rb 또한 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모)11,,1213수정 될 수 있습니다.
스모 다양 한 대상 단백질에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질 이다. 그것은 세포 주기 규칙을 포함 하 여 다양 한 세포질 프로세스에 대 한 중요, 전사, 단백질 세포질 지 방화 및 저하, 전송, 및 DNA 복구14,,1516, 17 , 18.에 스모 활용 통로로 구성 되어 dimeric 스모 E1 활성화 효소 SAE1/UBA2 단일 E2 conjugating 효소 Ubc9, 여러 E3 ligases, 스모 관련 프로 테아 제. 일반적으로, 초기 스모 단백질 proteolytically 성숙한 형태를 생성 하기 위해 처리 되어야 합니다. 성숙한 스모 E1 heterodimer에 의해 활성화 하 고 Ubc9 E2 효소로. 마지막으로, 스모의 C-터미널 글리신 covalently, 기판의 대상 리에 활용 된 그리고이 과정은 일반적으로 E3 ligases에 의해 촉진 된다. 스모 단백질 특정 프로 테아 제에 의해 수정 된 기판에서 제거할 수 있습니다. 이 문서의 저자에 의해 이전 연구 Rb SUMOylation CDK2에 그것의 바인딩을 초기 g 1 단계, 세포 주기 진행13에 필요한 과정에서 인 산화 하이퍼로 이어지는 증가 밝혀. 우리는 또한 Rb SUMOylation의 손실 감소 셀 확산 원인 설명 했다. 또한, 그것은 최근에 Rb의 SUMOylation proteasomal 회전율에서 따라서 셀19Rb 단백질의 수준을 증가 Rb 단백질을 보호 시연 했다. 따라서, SUMOylation 다양 한 세포질 프로세스에서 Rb 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 추가 연구를 기능 결과 Rb SUMOylation의 생리 적인 관련성 그건 인간의 세포 또는 환자 조직에서 Rb의 스모 상태를 분석 하는 효과적인 방법을 개발 하는 것이 중요.
SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정 이다입니다. 따라서, 완전히 생 조건에서 스모 수정 단백질을 검출 하기 위하여 일반적으로 어렵습니다. 이 종이 생 Rb SUMOylation 검색 하는 메서드를 제공 합니다. 또한, 그것은 야생-타입 Rb와 그 스모 결핍 돌연변이11외 인 Rb SUMOylation 감지 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 제이콥스 외. 주어진된 기판의 스모 수정 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD)20특히 증가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에 따라,이 프로토콜은 Rb의 강제 SUMOylation 그리고 그것의 기능적인 결과 분석 하는 방법을 설명 합니다. 스모 기판의 수백 설명한가지고 있고 더 많은 putative 스모 기판 많은 proteomic 기반 분석 실험에서 확인 되었습니다,이 프로토콜 분석 인간 세포에이 단백질의 SUMO 수정에 적용할 수 있습니다.

<table style="border-collapse:collapse;width:695pt" width="927">
	<colgroup>
		<col style="width:275pt" width="366" />
		<col style="width:206pt" width="275" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11995065</td>
			<td class="xl68" style="width:125pt" width="167"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Opti-MEM&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">31985070</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140079</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010023</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25200056</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Thymidine</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">T9250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nocodazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M1404</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">propidium iodide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">P3566</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Triton X-100&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">694</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">RNase A&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">EN0531</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">N-Ethylmaleimide</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">E3876&#160;</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M107</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">M158</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">protease inhibitor</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Roche</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">5892970001</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2025</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Rb antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Cell Signaling Technology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">#9309</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Protein A/G-Sepharose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">sc-2003</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Lipofectamine-2000&#160;</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">11668019</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Qiagen</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">30230</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Imidazole</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Sigma</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">I0250</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">BIO-RAD</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">4561096</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl68" height="21" style="height:15.75pt">Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Millipore</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">IPVH00010</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tween-20</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">AMRESCO</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M147</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">Tubulin antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M30109</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">SUMO1 antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">33-2044</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">GFP antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Abmart</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">M20004</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="23" style="height:17.25pt">
			<td class="xl65" height="23" style="width:275pt;height:17.25pt" width="366">Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">715-035-150</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:275pt;height:15.75pt" width="366">enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td>
			<td class="xl65" style="width:206pt" width="275">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl71" style="width:89pt" width="119">32106</td>
			<td class="xl68"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 lysed. 스모 프로 테아 제 억제제, N-Ethylmaleimide, 실험 기간 동안 네이티브 스모 신호를 보존 하기 위해 20 mM의 최종 농도에 추가 되었습니다. 비 공유 난다 상호 작용, 그리고 안티-SUMO1 항 체를 사용 하 여 다음 서쪽 오 점 차단 조건을 변성 시키기 아래 생 Rb 종의 immunoprecipitation, 후 스모 신호의 존재 특히 감지에 초기 g 1 단계 (그림 2). 비록 글로벌 SUMOylation S/G2/M 단계에 있는 시간 포인트의 Rb SUMOylation, 강화 되었다 (그림 2, 입력된 패널)는 변경 되지 않습니다 했다. 이 찾는 Rb의 SUMOylation 단순히 변경 된 글로벌 스모 활용 활동의 결과가 아니다는 것을 건의 한다. 따라서, 단백질 immunoprecipitation 및 서양 오 점 분석이이 문서에 설명 된 이러한 결과 보기 생 Rb 단백질의 SUMOylation의 검출에 대 한 수 있습니다.
생성 된이 연구 Rb 단백질의 강제 SUMOylation 감지 하려면 제정 SUMOylated Rb Ubc9, 효율적이 고 선택적 SUMOylation의 Rb(그림 3)에 대 한 수 있도록 그것의 C-터미널 단독 스모 E2 리가 융합 하 여 생성 합니다. Ubc9, C93S의 손실의 기능 돌연변이 컨트롤 (그림 3A)으로 Rb의 C-터미널 또한 융합 된다. 스모-Rb 신호의 특이성 강화, 하 비 융합 Ubc9 혼자는 또한 건설 되었다. 그들은 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed 했다 전에 그의 태그 플라스 미드의 모든 4 48 h HEK293 세포로 페 했다. 모든 단백질이이 종이의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 다음 풀 분석 결과, 다운 받게 했다. 서쪽 오 점에 의해 eluted Rb 단백질 분석 되었다. Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation Rb Ubc9 결함이 있는 돌연변이, C93S,이 신호를 생성 하는 데 실패 반면 안티-SUMO1 항 체 (그림 3B, SUMO1 패널)를 사용 하 여 발견 되었다. 도 수 높은 분자량 밴드 Ubc9-퓨전 리드도 인해 고효율 스모 수정 Rb 항 체를 사용 하 여 직접 검색할 수 및 스모 신호 (그림 3B, Rb 패널)에 해당. 또한, Ubc9 혼자 일으키지 않았습니다 어떤 스모 활용 Rb-특정 SUMOylation (그림 3B)를 추가 확인.
SUMO1 Rb 단백질11리 720 활용은, 때문에 더 Rb SUMOylation 분석이 연구 생성 스모 불충분 한 돌연변이 아르기닌 (K720R)와이 리 진 잔류물을 대체 하 여. 두 개의 뚜렷이 표현된 Rb 단백질의 SUMO 활용의 탐지를 촉진 하기 위하여 GFP SUMO1 구문 세포내 스모 신호를 향상 시키기 위해 추가 되었습니다. 그의 태그 야생 타입 또는 돌연변이 Rb 공동 transfected GFP-SUMO1, 풀 다운 분석 결과 및 Rb-SUMO1 활용 능력의 분석 이어서 함께 HEK293 세포로 했다. 관찰, K720R 돌연변이 Rb, Rb SUMOylation (그림 4)를 검색 하는 제안된 된 방법의 기능 강화의 스모 수정 완전히 폐지.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig1.jpg"> 
그림 1 : Cytometry에 의해 세포 주기 동기화 분석 결과의 유효성 검사. HEK293 세포 배양 되었고이 프로토콜에서 설명으로 세포 주기 G1, S, G2/M 단계 G0, 초기 g 1에서 동기화. 세포 주기 분포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 결정 되었다. 대표 데이터 FACS 분석 결과의 정량 분석의 예를 보여 줍니다 (n = 1). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig2.jpg"> 
그림 2 : Rb 초기 g 1 단계에서 SUMOylated입니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 HEK293 세포 세포 주기의 다른 단계에 동기화 했다. 셀 수집 되었고 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed. 입력된 컨트롤 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤에 적재 했다, 전송, 그리고 안티-SUMO1와 반대로 Tubulin 얼룩이 표시. 나머지 세포 lysates 다음 1: 200의 희석에 안티-Rb 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitation를 받게 했다. 결과 eluents 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤 및 안티-SUMO1 항 체와 안티-Rb 항 체를 사용 하 여 immunoblotted로 구분 했다. 이 실험은 동일한 결과를 두 번 반복 했다. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig3.jpg"> 
그림 3 . Rb Ubc9 융합 단백질의 SUMO 수정. (A)의 Rb. (B) 제정 SUMOylation의 Rb UFD로 인 한의 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD) 구문 다이어그램. HEK293 세포 뚜렷이 그의 태그 UFD 구문 페 20 m N Ethylmaleimide RIPA 버퍼에서 lysed 했다. 각 샘플의 lysate 총 풀 태그 그의 Rb Ubc9 융합 단백질 또는 Ubc9 (부정적인 제어로 사용), 각각 다운 Ni NTA agarose 구슬 incubated 했다. 순화 된 단백질은 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤과 immunoblotted 안티-SUMO1와 반대로 그의 항 체에 의해 분리 되었다. 그의-Rb: 6XHis 태그 Rb Ubc9 융합 단백질; Ubc9: 그의 6XHis만 Ubc9 태그. Rb-Ubc9: 수정 되지 않은 Rb-Ubc9; -Ubc9 s: Rb-Ubc9 SUMOylated Rb; 하이퍼-pRb-Ubc9: 하이퍼 phosphorylated Rb-Ubc9. 그림에 표시 된 결과 3 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56096/56096fig4.jpg"> 
그림 4 . 스모-불충분 한 K720R 돌연변이 감소 Rb의 SUMOylation. HEK293 세포 GFP SUMO1 함께 야생 유형 또는 돌연변이 Rb-그의 구문으로 공동 transfected 뚜렷이 했다. 셀 수집 되었고 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed. lysates의 작은 부분 서쪽에 의해 분석 직접 입력 컨트롤로 오 점. 나머지는 lysates의 Ni NTA agarose 구슬 풀 태그 그의 Rb 단백질이이 프로토콜에서 설명 된 대로 다운 incubated 했다 그리고 그들은 안티-SUMO1와 반대로 그의 항 체 immunoblotted. Rb의 720에서 라이 신-아르기닌 돌연변이 더하다 note동맹 말살이 단백질의 SUMO 수정. 실험 실시 했다 한 번으로 그 비슷한 결과 이전 보고11. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56096/56096fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>솔루션</td>
			<td>구성 요소</td>
			<td>코멘트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA 세포의 용 해 버퍼</td>
			<td>50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1 %NP-40; 1% 나트륨 deoxycholate; 0.1% SDS</td>
			<td>즉시 사용 하기 전에 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 N-ethylmaleimide를 추가 합니다.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>워시 버퍼</td>
			<td>50mm NaH2포4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM 이미</td>
			<td>분석 결과 다운 풀 사용</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>차입 버퍼</td>
			<td>50mm NaH2포4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 250 m m 이미</td>
			<td>분석 결과 다운 풀 사용</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>버퍼를 로드 x 6</td>
			<td>0.5 트리 스 M, pH 6.8; = 30% 글리세롤; 10 %SDS; 5% β-mercaptoethanol; 0.1 %bromphenol 블루</td>
			<td>-20 ° C에서 저장소</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>버퍼를 실행 x 10</td>
			<td>0.25 M Tris, pH 8.6; 1.9 M 글리신; 1% SDS</td>
			<td>실행 버퍼 x 1을: 900 mL ddH2O 실행 버퍼 x 10 100 ml를 혼합</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>전송 버퍼 x 10</td>
			<td>0.25 M Tris, pH 8.3 1.9 M 글리신</td>
			<td>전송 버퍼 x 1을: x 200 ml 메탄올에 대 한 전송 버퍼와 700 mL ddH2O 10 100 mL를 혼합</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x TBS 버퍼</td>
			<td>DdH2소개할 24.08 g 트리 스 pH 7.4; 1 리터에 80 g NaCl</td>
			<td>TBST 버퍼 x 1을: 900 mL ddH2O와 트윈-20의 1 mL 100 mL 10 x TBS 버퍼를 혼합</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>버퍼를 차단</td>
			<td>1 5% 무 지방 건조 우유와 함께 x TBST</td>
			<td>즉시 사용 하기 전에 버퍼를 준비</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>항 체 희석 버퍼</td>
			<td>1 3 %BSA 0.02% 나트륨 아 지 드와 x TBST</td>
			<td>이 버퍼는 4 ° C에 적어도 6 달 동안 저장 될 수 있었다</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 솔루션 및 버퍼

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In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K 조회수.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

비디오: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

비디오 생물 정보학 인간의 배아 줄기 세포 콜로니 성장 분석

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

연구

생물학

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...