KO와 AC는 미국 심장 협회에서 부여하고 화목에 의해 지원됩니다. SIB와 RB는 NIH에서 교부금에 의해 지원됩니다.

<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/SOHA_overview.pdf">세미 자동 심장 박동 분석 (하) 프로 시저의 개요를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 세미 자동 광학 심장 박동 분석 1. Preprocess - 이 단계는 diastolic과 수축기 심장 직경에 대한 정보를 제공합니다. 심장 가장자리는 최대 심장 확장과 심장 수축 동안 식별 및 표시됩니다. 광학 녹음도 속도가 느린 속도와 마음의 최대한의 수축과 이완이 발생 프레임의 정확한 신분을 수 있도록 한 번에 하나의 프레임에 고급 수 있습니다. 수축기 가장자리를 식별 diastolic 가장자리 한 켤레를 식별할 수있는 표시 중 하나 쌍이 만들어집니다. 마크는 심장 따라 서로 다른 수평 위치에 중복에도 만들 수 있습니다. 이 단계에서 얻은 심장 지름도 심장의 수축성의 추정치를 제공하는 추가적인 측정을 계산하는 데 사용됩니다. 이 법안은 소수 퍼센트 단축 (% FS)이며 그것은 심장 모서리가 수축하는 동안 서로쪽으로 이동 범위를 나타냅니다. %의 FS를 계산에 사용되는 공식은 다음과 같습니다 : (((Diastolic 직경 - 수축기 직경) / Diastolic 직경) × 100) 참고 -이 세트의 식별 포인트는 직경 부분 단축 측정에만 사용되며 움직임 감지에 사용되지 않습니다. 예 : (. Cammarato, 동부 표준시 알 2008) Drosophila에서 포인트 돌연변이가 마이 오신 중쇄의 변환기 도메인에 알려진 지역 모터의 효소 활동, 그들이 마이 오신의 ATPase 활동을 억제 또는 개선 여부에 따라 확대 또는 제한됩니다 마음에 결과를 조절하는 . 그것은 표피와 지방을 통해 심장 튜브의 전체 길이를 따라 심장 가장자리를 식별하는 데 일반적으로 불가능으로 측정 이러한 종류 (Wildtype을 비교, D45 및 Mhc5 &quot;M - 모드에서 M - 모드, 손상 파리에서 만들 수 없습니다 일반적으로 심장을 둘러싸고있는 아래의 그림 &quot;). 기타 일반적으로 고용 방법으로 그대로 파리의 마음을 시각화 때 만든 측정은 일반적으로 심장의 가장 앞쪽에 부분, 원뿔 챔버 지역으로 제한되어 있습니다. 그것은 고정 조직이 역동적인 측정을 얻을 수도 없습니다. 2. 운동 감지 - 이 단계는 프로그램에 의해 자동으로 수행하고 각 영화에 움직임을 분석하는 두 개의 서로 다른 알고리즘을 사용합니다. 간단히, 첫 번째 알고리즘은 &quot;평균 프레임 암흑&quot;알고리즘은 프레임 방식으로 프레임을 사용합니다. 이 알고리즘의 평균 전체 영화 프레임에 대한 어둠의 강도는 0과 1 사이의 간격 값을 normalizes하고, 플롯 시간이 지남에 따라 영화의 모든 프레임에 대한 표준 평균. 두 번째 접근 알고리즘 &quot;픽셀의 픽셀은&quot;하나의 프레임에서 다음의 모든 개별 픽셀의 어둠의 변화를 분석합니다. 미리 임계값 이상의 강도 변화를 전시 픽셀은 각 프레임에 대한 표현하고 시간이 지남에 따라 영화의 모든 프레임 꾸몄다 있습니다. 3. 간격을 - 확인 두 운동 탐지 알고리즘의 출력은 출력 창에있는 &quot;픽셀의 픽셀&quot;위의 창에 표시 &quot;에 관한 어둠&quot;출력이 모듈에 표시됩니다. 검색 간격 우리가 직접 알고리즘 출력 창 아래에 분석되는 프레임에서 만든 모서리 추적하거나 M 모드를 표시합니다 실제 영화 운동에 동의하는지 확인하기 위해. M - 모드는 디지털 영화의 각 프레임에서 심장을 관통 조각에게 넓은 한 픽셀을 절단하고 시간이 지남에 심장 에지 운동의 스냅샷을 제공하기 위해 수평을 정렬하여 이루어집니다. 윈도우의 &quot;픽셀의 픽셀&quot;의 식별​​ diastolic 간격이 바로 위에 그 간격에 기여하는 프레임의 번호와 수평 녹색 라인으로 표시됩니다. 수축기 간격 두 연속 diastoles 사이의 간격으로 식별됩니다. 수축기의 시작은 수직 파란 선으로 M - 모드에서 표시됩니다 결국은 수직 빨간 선으로 표시됩니다. 이 디스플레이는 알고리즘 출력이 실제 심장의 움직임에 동의 있는지 확인하기 위해 상대적으로 쉽습니다. 동작 감지 기능이 자동으로 수행되지만 출력은 정확성을 위해 검사해야합니다. 이것에 대한 몇 가지 이유가 있습니다, 하나는 심장의 움직임과 관계없는 가벼운 수준의 기본, 느린 웨이브 변동이 자주있다는 것입니다. 이것은 일반적으로 하이 패스 필터의 내장의 사용에 의해 제거될 수 있습니다. 두 번째 이유는 접근 &quot;픽셀의 픽셀&quot;의 감도로 할 수있다. 이 알고리즘의 출력은 일반적으로 2 이동 추적, 수축 운동 한과 휴식을위한 운동입니다. 시간의 길이를 기존의 파리에서 일부 돌연변이의 두 동작 사이<html> 비교적 긴되고 프로그램은 두 개의 비트로 두 움직임을 해석하려고합니다. 이것은 &quot;사용 어둠 &#39;상자를 클릭하여, 평균 프레임 암흑 알고리즘의와 픽셀 알고리즘에 의해 픽셀의 출력을 비교하는 프로그램을 요구하는 수정하실 수 있습니다. 예 (비디오 참조) : 이전 5-7주에서는 수축기 간격은 일반적으로 젊은 파리에서보다 훨씬 더 이상 날아. 이러한 긴 간격은 처음에는 짧은 음절 연장으로 구분된 두 개의 별도의 수축으로 감지됩니다. 이것은 &quot;사용 어둠&quot;확인란을 선택하여 수정하실 수 있습니다. 이 경우 프로그램은 평균 프레임 어둠은 출력 픽셀 알고리즘에 의해 픽셀로 식별 diastolic 간격을 비교합니다. 평균 프레임 암흑 출력 긍정적인 가치가있다면, 픽셀 알고리즘에 의해 픽셀에서 확인된 모든 diastolic 간격은 무시되고 간격이 올바르게 지정됩니다. 전체 영화가 10초 세그먼트에서 스캔하여 접수 ( &quot;OK 데이터&quot;를 클릭) 또는 ( &quot;데이터 삭제&quot;를 클릭) 거부하실 수 있습니다. 안녕과로 패스 필터 감성은 수동으로 어둠의 알고리즘을 채용하면 수축 간격을 정의할 수 있도록보다 정확하게 조정할 수 있습니다. 4. 출력 통계 - 특정 영화에 대한 출력이 수락된되면 프로그램이 자동으로 매개 변수의 수를 계산하는 정보를 사용합니다. 이들은 diastolic과 수축기 간격, 심장 기간 및 심장 박동, 방향 및 수축 파, 심장 직경, 그리고 % FS의 속도를 포함합니다. 또한, 프로그램이 아닌 균일한 수축과 이완의주기 (핑크 외, 2009 참조) 반영 arrhythmicity를 quantifying에 대해 여러 방법이 있습니다. 통계 출력은 개별적으로 각 영화 및 Microsoft Excel과 같은 스프레드 시트 프로그램에서 열 수있는 쉼표로 구분된 값 형식 (. CSV) 파일에 설정 전체 데이터 제공됩니다. 표 1 - <img src="/files/ftp_upload/1435/1435table1.jpg" alt="table1" /> 세미 자동 광학 심장 분석 프로그램에 의해 생성된 출력의 예입니다. 5. 업데이트 Histograms - 프로그램의이 부분은 막대 그래프 형식의 데이터 세트에 대한 마음의 간격에있는 모든 데이터를 표시합니다. 심장 요금 변수 때문에 우리는 히스토그램 출력 데이터를 정상화. 그러나, 간격의 분포는 주위에 대칭이 아니기 때문에 것은 우리의 정상화에 대한 중간 간격 값을 사용 의미합니다. 예 (비디오 참조) : KCNQ 칼륨 채널에 대한 돌연변이 아르 파리가 매우 불규칙 diastolic 및 수축기 간격을 보여줍니다. 일반적으로 수축기 간격이 훨씬 길고 연령 일치 wildtype의 파리보다 더 불규칙한 수 있습니다. 이것은 명확하게 (Ocorr 외도 참조하십시오. 2007) 히스토그램 형식으로 데이터를 표시하여 볼 수 있습니다. 6. M - 모드 이 모듈은 영화 프레임의 심장부에 따라 어떤 위치에서 만들 수있는 M - 모드 것을 생성합니다. M 모드의 길이도 지정할 수 있습니다. M - 모드는 심장이 영화에서 뭐하는 질적 보여 유용합니다. 예 (비디오 참조) : M - 모드를 생성하는 데 사용되는 앞쪽에 뇌실을 보여주는 삼일 오래된 zebrafish 애벌레 심장의 영화. 전자 각 영화 프레임 excised 될 픽셀의 수직 단면은 빨간색 선으로 표시됩니다. M - 모드 그림 : Drosophila와 zebrafish에서 M - 모드의 예. 빠른 심장 제한의 결과로 효소 반응 속도론 및 때때로 전도 블록과 분자 모터의 Preprocess 단계 결과에서 설명하는 마이 오신의 돌연변이 중 하나. 두 매개 변수가 질적 M - 모드를 사용하여 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig1.jpg" alt="M - 모드의 예" /> wildtype 및 돌연변이 파리가 모두 마음의 동일한 부분에서 만든 M - 모드는 명확하게 MHC 5 돌연변이와 열려진 직경과 (우울 효소 속도론과 마이 오신을 표현) D45 돌연변이의 arrhythmic 수축주기에 제한 표현형을 표시 (수정 Cammarato 동부 표준시. 알, 2008). 앞쪽에 뇌실 (데모, 핑크 et.al. 2009 년 그림과 같이 같은 심장 영화)를 보여주는 Zebrafish 애벌레 마음에서 만든 M - 모드를 사용합니다. 7. 레드 다트 영화 - 이 모듈은 자동으로 빨간색으로 변화로 식별되는 모든 픽셀을 보여주는 분석 영화의 둔화 (1시 4분), 20 번째 버전을 생산하고 있습니다. 이 기능은 주로 일러스트 목적으로 사용됩니다. 동영상 1 - 빨간색으로 프로그램 알고리즘에 의해 어둠의 강도를 변경 것으로 식별하는 픽셀을 보여주는 &quot;레드 도트 영화&quot;. 동영상 속도는 4 요인에 의해 원래의 둔화됩니다. w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi는 &quot;&gt; 영화 1 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 8. 추가 애플 리케이션 우리는 종종 전통적인 방법론을 사용하여 분석하기 어려운 작은 마음으로 다른 모델의 고속 동영상이 분석 시스템을 적용하기 시작했다. 우리는 성공적으로 zebrafish 애벌레 마음 배아 마우스 하트 (핑크 외, 2009) 모두에이 분석을 적용합니다. 영화 2 - 마우스 심장 플러스 동영상 데이터 출력 확인 간격과 수치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1435/Mouse%20heart%20clip%201.avi">영화 2를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img src="/files/ftp_upload/1435/1435fig2.jpg" alt="마우스 심장 간격을 확인" />

<ol>
	<li>Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Transducer+mutations+differentially+affect+motor+function,+myofibril+structure,+and+the+performance+of+skeletal+and+cardiac+muscles.">Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles.</a> Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).</li><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -. S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging.">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li><li>Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+detection+and+quantification+of+heartbeat+parameters+in+Drosophila,+zebrafish+and+embryonic+mouse+hearts.">A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts.</a> Biotechniques. 46, 101-113 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Drosophila 모델 embryological 개발에서 학습 및 메모리에 이르기까지 과학 질문 다양한 주소로 사용되었습니다 강력한 유전자 도구로 입증되었습니다. 최근이 다양한 모델 생물은 심장 기능의 유전자를 조사하는 데 사용되었습니다. 성인 Drosophila의 심장 생리를 정할 시도의 숫자가 복부 표피를 통해 그대로 파리에서 만들어진 관측에 의존합니다. 이러한 방식의 대부분은 시각적 관찰을하거나 하나의 ...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MatLab software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Math Works, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required environment for the analysis software.</td>
</tr>
<tr>
<td>EM-CCD digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>9100 or 9300</td>
<td>Other high speed digital cameras will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>HC image data capture software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Other image capture software that produces movies in avi format will also work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Light Microscope with 10x objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

semi-automated optical heartbeat analysis of small hearts

우리는에서 고속 광학 녹음을 분석하는 방법을 개발했습니다<em&gt; Drosophila</em&gt; zebrafish 및 배아 마우스 하트 (핑크, 동부 표준시. 알., 2009). 우리 반자동 광학 도면 분석 (하)는 개인의 수축성 및 휴식 행사와 관련된 심장 움직임을 감지할 수있는 새로운 움직임 감지 알고리즘을 사용합니다. 이 프로그램은 수축기 및 diastolic 간격, 심장 박동,뿐만 아니라 심장 박동의 arrhythmicity의 질적 및 양적 조치를 포함한 생리학 관련 설치 했어요의 호스트를 제공합니다. 프로그램은 또한 부분 단축과 분수 영역 변경이 계산하는 심장 확장과 심장 수축을 모두하는 동안 심장 직경 측정을 계산합니다. 출력은 대부분의 스프레드 시트 프로그램과 호환 디지털 파일로 제공됩니다. 측정은 출력의 통계 능력을 증가 기록의 모든 하트 비트에 대해 만들어집니다. 우리는 사용자의 입력이 필요한 각 단계를 설명하고 세 가지 유전적으로 다루기 쉬운 심장 모델로 심장 기능의 분석을 위해 방법론의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts at JoVE.com

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

우리는에서 고속 광학 녹음을 분석을위한 세미 자동 광학 도면 해석 방법 (하)를 개발<em&gt; Drosophila</em&gt; zebrafish 및 배아 마우스 심장. 우리는 과일 비행 및 배아 마우스 마음에 심장 기능의 분석을 위해 방법론의 응용 프로그램을 보여줍니다.

작은 하트의 세미 - 자동 광학 도면 분석

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

semi-automated-optical-heartbeat-analysis-of-small-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K 조회수.  The Sanford Burnham Institute for Medical Research. 우리는에서 고속 광학 녹음을 분석을위한 세미 자동 광학 도면 해석 방법 (하)를 개발 Drosophila zebrafish 및 배아 마우스 심장. 우리는 과일 비행 및 배아 마우스 마음에 심장 기능의 분석을 위해 방법론의 응용 프로그램을 보여줍니다.

비디오: Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

현미경의 올바른 관리 및 청소

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

연구

생물학

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

라이트 현미경의 주요 구성 요소

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

LeafJ: An ImageJ Plugin for Semi-automated Leaf Shape Measurement

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the primary photosynthetic organ, and their size and shape vary developmentally and environmentally within a plant. For these reasons studies on leaf morphology require measurement of multiple parameters from numerous leaves, which is best done by semi-automated phenomics tools5,6. Canopy shade is an important environmental cue that affects plant architecture and life history; the suite of responses is collectively called the shade avoidance syndrome (SAS)7. Among SAS responses, shade induced leaf petiole elongation and changes in blade area are particularly useful as indices8. To date, leaf shape programs (e.g. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) can measure leaf outlines and categorize leaf shapes, but can not output petiole length. Lack of large-scale measurement systems of leaf petioles has inhibited phenomics approaches to SAS research. In this paper, we describe a newly developed ImageJ plugin, called LeafJ, which can rapidly measure petiole length and leaf blade parameters of the model plant Arabidopsis thaliana. For the occasional leaf that required manual correction of the petiole/leaf blade boundary we used a touch-screen tablet. Further, leaf cell shape and leaf cell numbers are important determinants of leaf size13. Separate from LeafJ we also present a protocol for using a touch-screen tablet for measuring cell shape, area, and size. Our leaf trait measurement system is not limited to shade-avoidance research and will accelerate leaf phenotyping of many mutants and screening plants by leaf phenotyping.

Demonstration of key methods for high throughput leaf measurements. These methods can be used to accelerate leaf phenotyping when studying many plant mutants or otherwise screening plants by leaf phenotype.

LeafJ : 세미 자동 리프 형상 측정을위한 ImageJ 플러그인

High throughput phenotyping (phenomics) is a powerful tool for linking genes to their functions (see review1 and recent examples2-4). Leaves are the ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over the past two decades, we have developed a yeast membrane protein expression platform that has been used to study many important fungal membrane proteins. The expression host Saccharomyces cerevisiae AD&#916;&#916; is deleted in seven major endogenous ABC transporters and it contains the transcription factor Pdr1-3 with a gain-of-function mutation that enables the constitutive overexpression of heterologous membrane protein genes stably integrated as single copies at the genomic PDR5 locus. The creation of versatile plasmid vectors and the optimization of one-step cloning strategies enables the rapid and accurate cloning, mutagenesis, and expression of heterologous ABC transporters. Here, we describe the development and use of a novel protease-cleavable mGFPHis double tag (i.e., the monomeric yeast enhanced green fluorescent protein yEGFP3 fused to a six-histidine affinity purification tag) that was designed to avoid possible interference of the tag with the protein of interest and to increase the binding efficiency of the His tag to nickel-affinity resins. The fusion of mGFPHis to the membrane protein ORF (open reading frame) enables easy quantification of the protein by inspection of polyacrylamide gels and detection of degradation products retaining the mGFPHis tag. We demonstrate how this feature facilitates detergent screening for membrane protein solubilization. A protocol for the efficient, fast, and reliable isolation of the small-scale plasma membrane preparations of the C-terminally tagged Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressed in S. cerevisiae AD&#916;&#916;, is presented. This small-scale plasma membrane isolation protocol generates high-quality plasma membranes within a single working day. The plasma membrane preparations can be used to determine the enzyme activities of Cdr1 and Cdr1 mutant variants.

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

This article presents a small-scale plasma membrane isolation protocol for the characterization of Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) protein Cdr1, overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. A protease-cleavable C-terminal mGFPHis double tag with a 16-residue linker between Cdr1 and the tag was designed to facilitate the purification and detergent-screening of Cdr1.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...