많은 유전자 치료 및 신경 과학 연구는 AAV 벡터를 인간이 아닌 영장류의 뇌에 주사하는 것을 포함합니다. 이러한 연구가 성공하려면 주입 기술이 신뢰할 수 있어야합니다. 우리의 주입 기술은 즉각적이고 정확합니다.
이 절차는 마취되거나 깨어있는 동물에서 주사하는 데 효과적입니다. 우리의 수제 캐뉼러는 취급하기 쉽고 저렴합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어링 기술자 인 Kevin Mai가 될 것입니다.
시작하려면 디스크 그라인더로 30 게이지 13mm 피하 주사 바늘 끝을 무디게하십시오. 그런 다음 대상 뇌 영역의 깊이에 따라 길이로 스테인레스 스틸 튜브 조각을 자릅니다. 디스크 그라인더를 사용하여 절단 된 튜브의 한쪽 끝을 경사지고 다른 쪽 끝을 부드럽게합니다.
브로치로 튜브 내부를 디버링합니다. 다음으로, PTFE 튜브 조각을 로딩할 벡터 용액 부피에 적합한 길이로 자릅니다. 무딘 피하 주사 바늘을 삽입하여 튜브의 양쪽 끝을 플레어합니다.
무딘 피하 주사 바늘을 PTFE 튜브의 한쪽 끝에 약 5mm 삽입합니다. 그런 다음 스테인리스 스틸 튜브의 비스듬한 끝을 다른 쪽 끝에 약 5mm 삽입합니다. 피하 주사 바늘 허브를 통해 여과 된 물을 주입하여 캐뉼러를 테스트하십시오.
물이 비스듬한 스테인리스 스틸 튜브 팁에서 부드럽게 빠져나가고 어느 접합부에서도 물이 새지 않는지 확인하십시오. 캐뉼러를 테스트 한 후 오토 클레이브 백에 넣고 오토 클레이빙으로 멸균하십시오. 기포 형성을 피하면서 P-20 피펫터를 사용하여 벡터 용액을 멸균된 PCR 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
다음으로, 경 사진 팁이 아래를 향하도록 캐뉼러를 수직 방향의 스테레오 택시 홀더에 부착합니다. 그런 다음 1 밀리리터 루어 잠금 주사기를 캐뉼라의 피하 주사 바늘 허브에 연결하십시오. 비스듬한 팁을 벡터 솔루션에 잠급니다.
그런 다음 1 밀리리터 주사기로 부드러운 음압을 적용하여 용액과 공기 사이의 반월 상 연골을 시각적으로 추적하면서 용액을 캐뉼라에 넣습니다. 벡터 용액이 로드되면 용액이 바늘 허브에 도달할 때까지 부드러운 음압을 계속합니다. 그런 다음 1 밀리리터 주사기를 제거하고 피하 주사 바늘 허브의 내벽을 따라 유색 미네랄 오일을 천천히 주입하여 기포가 발생하지 않도록주의하십시오.
피하 주사 바늘 허브를 3방향 루어 잠금 스톱콕의 두 개의 열린 포트 중 하나에 연결합니다. 그런 다음 포트를 닫습니다. 1 밀리리터 주사기에 공기를 채우고 다른 두 포트 중 하나에 부착하십시오.
마지막으로 스톱 콕의 나머지 포트를 닫아 주사기를 캐뉼라에 연결합니다. 주사기를 부착하면 공기가 스톱콕으로 들어가고이 공기를 비어있는 포트로 분로하면 벡터 용액이 캐뉼라 아래로 다시 밀려나는 것을 방지 할 수 있습니다. 주사기의 공기를 캐뉼라로 천천히 밀어 넣습니다.
PTFE 튜브의 무딘 바늘 끝에 유색 오일이 나타나면 용액과 유색 오일 사이에 공기가 있는지 확인하십시오. 경 사진 캐뉼라 팁에 벡터 용액 한 방울이 보일 때까지 양압을 계속 적용하십시오. 그런 다음 벡터가 중력에 의해 캐뉼라를 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 스톱 콕을 닫습니다.
벡터 솔루션이 로드되면 캐뉼러를 스테레오택시 매니퓰레이터에 부착합니다. 그런 다음 스톱 콕을 전기 공기 펌프에 연결하려면 비 멸균 보조원에서 펌프 튜브를 가져 가십시오. 멸균 슬리브의 벽을 통해 루어 잠금 커넥터를 잡습니다.
슬리브의 칼라를 떨어 뜨려 중력에 의해 튜브를 따라 연장되도록합니다. 그런 다음 스톱 콕을 부착하고 슬리브를 루어 잠금 커넥터 주위에 단단히 테이프로 고정하십시오. 다음으로, 공기 펌프를 저압으로 설정하여 공기 펌프와 캐뉼러를 테스트한 다음 전원을 켜고 오일이 캐뉼라를 통해 진행하고 캐뉼라 팁에 벡터 용액 한 방울이 보일 때까지 압력을 높입니다.
플라스틱 자를 PTFE 튜브에 테이프로 붙여 주입하는 동안 반월판의 움직임을 측정합니다. 그런 다음 팁이 표면에 도달 할 때까지 정위 조작기로 캐뉼러를 아래로 내리고 깊이를 기록합니다. 캐뉼러를 트랙을 따라 주입 할 가장 깊은 부위로 운전하십시오.
접촉시 표면이 딤플됩니다. 조직 압박으로 인한 잘못된 표적화를 최소화하려면 캐뉼러를 아래로 내리고 가장 깊은 주사 부위를 500마이크로미터 초과합니다. 그런 다음 천천히 집어 넣으십시오.
다른 대안은 캐뉼러를 천천히 내리거나 빠르게 운전하고 바닥에서 1-5 분 동안 기다리는 것입니다. 캐뉼러가 가장 깊은 주입 부위에 위치하면 전기 공기 펌프를 사용하여 0.5 마이크로 리터의 벡터 용액을 10-30 초에 걸쳐 주입합니다. 착색된 오일과 PTFE 튜브의 벡터 용액 사이의 메니스커스를 추적하여 주입 흐름을 확인합니다.
1 분 동안 기다린 후 캐뉼러를 트랙을 따라 다음 주사 부위로 집어 넣습니다. 최종 주입 후, 벡터 유출을 피하기 위해 캐뉼러를 10 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 캐뉼러를 집어 넣고 생물학적 위험 날카로운 용기에 버립니다.
왼쪽 상공체에 채널 로돕신 II 전이유전자를 운반하는 AAV 벡터를 주입한 후 40밀리와트에서 연속 청색광으로 자극하면 일련의 연속적인 활동 전위가 생성되었습니다. 1 밀리 초의 광 펄스는 40 밀리 와트에서 활동 전위를 불러 일으키지 못했지만 160 밀리 와트에서는 안정적으로 불러 일으켰습니다. 시각적으로 유도 된 단속 단속에 의해 유발 된 우수한 colliculus의 광학 자극은 단속 단속 이득을 점차적으로 감소 시켰습니다.
이 변화의 느림은 광유전학적으로 유도된 가소성과 일치합니다. 망상 핵에 AAV 주사 후 안구 운동 vermis에 노란색 레이저 광을 전달하면 소뇌에 입력되는 이끼 섬유 활동이 억제됩니다. 이 억제는 소뇌의 출력 인 Purkinje 세포 활동을 감소 시켰습니다.
광유전학적 억제 동안, 발사 속도는 감소하고 파열 기공 패턴으로 변화하여, Purkinje 세포에 대한 억제된 이끼 섬유 입력이 두 번째 파열을 구동하여 단속 감속 단계에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 채널 로돕신은 안구 운동 버미스의 푸르킨제 세포에서만 독점적으로 발현되었다. 짧은 광 펄스의 전달은 분리된 Purkinje 세포의 단순 스파이크 활성을 증가시켰습니다.
단일 1.5 밀리 초의 광 펄스는 종종 하나 이상의 단순한 스파이크를 불러 일으켰습니다. 단속 단속 동안 발생하는 광유전학적 단순 스파이크 활성화는 단속 진폭을 증가시켜 안구 운동 파열 발생기에서 Purkinje 세포의 억제 역할을 확인했습니다. 캐뉼러의 기포는 오일 벡터 메 니스 커스를 방해하고 주입량 결정을 복잡하게 하며 유속의 미세 제어를 방해 할 수 있습니다.
이러한 이유로 기포 없이 벡터 솔루션을 로드하는 것이 이 절차에서 중요합니다. 주사 후 6-8 주 후에 광유전 학적 조작을 수행 할 수 있으며 조직 학적 분석을 위해 뇌 조직을 처리 할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구원은 소수의 동물에서 많은 벡터를 테스트 할 수 있으며, 이는 새로운 벡터의 개발 및 검증을 용이하게합니다.
현재 관심있는 특정 영역은 특정 신경 유형을 표적으로 삼는 벡터의 개발입니다.
