이 프로토콜은 인핸서 시퀀스가 발현을 유도할 수 있는지 여부뿐만 아니라 신체의 특정 부분에서 발현을 유도할 수 있는 위치를 시각화할 수 있기 때문에 중요합니다. 빠릅니다. 주사는 완료하는 데 10 분도 채 걸리지 않으며 리포터 유전자가 발현되는지 여부와 위치는 샘플 수집 후 며칠 이내에 볼 수 있습니다.
복제를 시작하려면 리포터 구성을 선택하거나 디자인합니다. 본원에 사용된 작제물은 인핸서 후보를 hsp68 최소 프로모터의 조절하에 발현된 EGFP 리포터 유전자의 3개의 주요 비번역 영역 내로 배치한다. 관심 서열을 증폭하고 벡터 내로 클로닝하기 위한 PCR 프라이머를 설계하기 위해, 깁슨 클로닝을 위한 적절한 상동성 암을 프라이머의 5개의 프라임 말단에 추가한다.
설계된 프라이머를 사용하여 DNA 샘플로부터 PCR을 수행합니다. 필요한 클로닝 반응의 원하는 수에 따라 Pac1 및 Asc1을 사용하여 1-10 마이크로그램의 벡터 DNA를 분해합니다. 100 볼트에서 30 내지 60 분 동안 0.7 내지 1 % 겔 전기 영동을 사용함으로써, 제한 다이제스트 단편을 분리한다.
선형화된 벡터에 대한 밴드를 추출하고 상용 겔 추출 키트로 정제합니다. Gibson 클로닝 및 세포 형질전환이 완료되면 세포를 선택적 배지에 플레이팅하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 리포터 구축물의 성공적인 클로닝을 확인한 후, 글리세롤 스톡을 사용하여 5 밀리리터의 스타터 배양물을 접종한다.
섭씨 30도, 분당 180 회전의 진탕 인큐베이터에서 8-16 시간 동안 배양 물을 성장시킵니다. 국물이 흐려지면 스타터 배양 1, 000x를 250-300 밀리리터의 신선한 선택적 LB 국물에 희석하고 섭씨 30도 및 분당 180 회전의 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 상용 플라스미드 맥시 키트를 사용하여, 플라스미드를 정제한다.
ITR의 재조합을 테스트하려면 Xma1 분해를 수행합니다. 밴드를 시각화합니다. 다이제스트에 예상 밴드 수가 표시되는지 확인합니다.
재조합으로 인해 예상보다 적은 밴드가 생성됩니다. 전달을 위해 재조합 AAV 혼합물을 준비합니다. 다중 인핸서 리포터 바이러스의 발현 패턴을 비교하는 경우, 각 바이러스를 희석하여 바이러스 역가를 가장 덜 농축된 바이러스와 동일시한다.
인핸서 리포터 바이러스와 구성적으로 발현된 대조군 리포터 바이러스를 2:1 또는 3:1의 비율로 혼합한다. 최종 농도가 0.06%인 빠른 녹색 염료를 소량 첨가마이크로리터 눈금이 새겨진 모세관으로 만든 당겨진 유리 피펫의 끝을 부드럽고 보푸라기가 없는 물티슈에 부드럽게 뚫어 부수십시오. 미세 모세관 피펫을 고정하기 위해 고무 개스킷에 연결된 압력 적용 장치를 사용하여 피펫을 흡인기 어셈블리에 삽입합니다.
흡인기를 통해 음압을 가하여 약 0.2-0.5 마이크로 리터의 미네랄 오일을 피펫에 소량 흡입합니다. 흡인기 어셈블리를 옆에 두고 주사할 준비가 될 때까지 바이러스를 얼음 위에 놓습니다. 신생아 마우스를 냉동 마취 한 후 흡인기 어셈블리를 사용하여 음압을 가하고 반월 상 연골이 2 마이크로 리터 눈금 표시를 통과 할 때까지 당겨진 유리 피펫에 바이러스 혼합물을 그립니다.
차가운 챔버에서 마우스를 꺼내 벤치 상단에 놓습니다. 람다와 브레그마 사이의 중간에 있는 양측 주사 부위와 시상 봉합사와 각 눈을 찾습니다. 알코올 물티슈를 사용하여 소독하십시오.
당겨진 유리 피펫을 사용하여 신생아 마우스의 두개골을 뚫습니다. 바늘이 두개골에 들어가면 흡인기 어셈블리를 통해 양압을 가하십시오. 1 마이크로 리터의 바이러스를 측심실에 분배하고 피펫을 빼냅니다.
마우스를 가열 패드 또는 온난화 챔버에 올려 복구하십시오. 깨어 나면 동물을 집 새장으로 되돌립니다. 저배율 5x 주관 렌즈를 사용하여 뇌 부분을 가로지르는 형광 이미지를 기록합니다.
주사 부위를 찾아 적색 형광 세포의 밀도와 강도에 따라 바이러스 형질 도입 정도를 평가합니다. 유사하게 형질 도입 된 동물을 비교하십시오. 25배 이상의 고배율 대물 렌즈로 형광 이미지를 기록합니다.
그런 다음 해석 소프트웨어를 열고 3x3 중앙값 필터를 적용하여 노이즈를 줄입니다. 프로세스 메뉴를 클릭한 다음 노이즈를 클릭하고 얼룩 제거 옵션을 선택합니다. 다음으로, 이미지에서 배경 형광을 빼려면 먼저 다중 채널 이미지의 채널을 분리합니다.
이미지 메뉴를 클릭한 다음 색상을 클릭하고 채널 분할 옵션을 선택합니다. 사각형 또는 원 선택 도구를 사용하여 형광 셀이 없는 이미지 영역에 작은 모양을 그립니다. 분석, 측정을 차례로 클릭하여 배경의 평균 픽셀 강도를 측정하고 샘플링을 여러 번 반복합니다.
5-8개의 배경 영역에서 평균 회색 값의 평균을 구하고 10진수 값을 삭제합니다. 처리 메뉴를 선택하여 이미지의 각 픽셀에서 값을 뺀 다음, Math and Subtract(수학 및 빼기)를 클릭하십시오. 그런 다음 뺄 배경 값을 입력하고 확인을 클릭합니다. 필요한 경우 이미지 메뉴를 선택하여 채널을 다중 채널 이미지로 다시 병합한 다음 색상을 클릭하고 채널 병합을 선택합니다.
녹색 형광 세포의 수를 계산하려면 녹색 채널을 숨기고 자유형 선택 도구를 사용하여 빨간색 형광을 나타내는 뇌 영역 주위에 모양을 그립니다. 측정 기능을 클릭하여 선택한 영역에서 빨간색 채널의 면적, 통합 밀도 및 평균 회색 값을 측정합니다. 다지점 선택 도구를 사용하여 녹색 셀의 수를 계산하고 빨간색 채널의 통합 강도로 녹색 셀의 수를 정규화합니다.
양성 AAV 구축물로 P0에 두개내로 주사한 마우스를 인핸서 리포터로 형질도입한 후, 주사 28일 후 피질의 중간 하층에서 인핸서 구동 EGFP 발현을 보였다. P0에서 음성 대조군 작제물을 주입한 마우스는 주사 후 28일째에 EGFP의 어떠한 발현도 나타내지 않으며, 이는 인핸서 요소가 마우스 뇌에서 EGFP의 전사를 유도하는 것으로 밝혀졌음을 입증한다. 성공적으로 변환된 영역을 시각화하고 잠재적 변동성을 제어하기 위해 AAV 전달 인핸서 리포터 라이브러리를 다양한 역가의 검사했습니다.
후보 인핸서의 높은 역가 라이브러리는 광범위한 EGFP 발현을 유도하는 반면, 후보 인핸서의 낮은 역가 라이브러리는 P7 마우스 뇌에서 희소 한 CGFP 발현을 유도합니다. 활성이 없는 인핸서와 실패한 전달을 구별하기 위해 모든 주사에서 인핸서 리포터 AAV를 양성 대조군과 혼합하는 것이 중요합니다. 이 절차는 면역 조직 화학, RNA FISH 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱과 결합하여 인핸서가 활성화되는 세포 유형을 결정할 수 있습니다.
