우리의 방법은 임신 및 비 임신 동물의 자궁 조직에 존재하는 다른 림프구 하위 집단의 조성 및 기능적 특성의 평가를 가능하게합니다. 이 프로토콜은 단백질, 세포 생존 가능성 및 기능성의 표면 발현을 유지하면서 자궁 림프구를 분리할 수 있게 합니다. 따라서 후속 응용 프로그램의 범위에 적합합니다.
실험 의 시작 부분에 태아 제거 및 백혈구 수집은 기술적으로 도전적인 단계입니다. 긴 실험이기 때문에 항체 염색 단계에 도달하면 특히 주의와 초점이 필요합니다. 먼저, 임신 한 C57 블랙 6 여성 마우스에서 수확 한 자궁 조직을 멸균 페트리 접시에 옮긴 다음 멸균 기구를 사용하여 조직을 둘러싼 지방을 부드럽게 제거하여 조직을 건조시키지 않도록주의하십시오.
각 이식 부위를 멸균 기구로 해부하여 태아를 제거한 다음 자궁을 수집 매체 1밀리리터를 포함하는 원래 5밀리리터 수집 튜브로 되돌려 보냅니다. 가위를 사용하여 수집 튜브에 조직을 다진 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 다음으로 튜브에 미리 따뜻하게 된 효소 소화 믹스의 3 밀리리터를 추가합니다.
효소 소화 활동을 향상시키기 위해 교반과 섭씨 37도에서 30 분 동안 튜브를 배양하십시오. 잠복이 완료 된 후, 튜브를 소용돌이, 효소 활동을 억제하기 위해 얼음에 보관, 다음 제대로 라벨 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 소화 조직을 전송. 5밀리리터 수집 튜브를 총 10밀리리터의 얼음 차가운 5밀리롤러 EDTA PBS 용액으로 헹구고 나머지 모든 조직을 수집하고 15밀리리터 원심분리관으로 이송합니다.
소화된 조직 샘플을 400회 G.에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 부드럽게 쓸어낸 다음, 미리 데워진 5밀리머 EDTA PBS 용액의 10밀리리터로 재장매합니다. 세포 응집을 줄이기 위해 샘플을 섭씨 37도에서 교반으로 배양한 다음 10초 동안 높은 소용돌이를 피하십시오. 분리되지 않은 조직에서 세포 덩어리를 제거하기 위해 멸균 50 밀리리터 원심분리기 튜브 위에 70 마이크로미터 스트레이너를 배치한 다음 멸균 1 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 소화된 조직을 튜브로 강제로 넣습니다.
모든 세포를 수집하기 위해 총 10 밀리리터의 차가운 PBS로 여과기를 여러 번 세척한 다음, 50 밀리리터 원심분리기 튜브를 400배 G.에서 10분 동안 소비합니다.슈퍼나탄을 버린 후, 선천성 림프세포는 옵션 A 또는 옵션 B.For 옵션을 사용하여 분리될 수 있으며, 5밀리리터의 펜촉을 사용하여 펠릿을 80%의 소각로 재가동할 수 있다. 그런 다음 느린 속도에 파이펫 보이를 사용하여 15 밀리리터 원심 분리기 튜브의 재일시 처리된 펠릿에 통화 용액 당 40 %인 8 밀리리터를 조심스럽게 오버레이합니다. 파이펫은 15밀리리터를 약 45도 각도로 유지하며 천천히 연속합니다.
오버레이를 방해하지 않고, 중간 가속과 실온에서 최소 휴식으로 850배 G에서 20분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 콜 레이어당 방해하지 않고 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오. 다음으로 콜 당 두 개의 인터페이스에서 백혈구의 고리를 방해하지 않고 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 통화 층당 상단의 0.5 ~ 1 밀리리터를 제외한 모든 것을 폐기하십시오.
파이펫으로 흡입된 콜당 용액의 양을 최소한으로 유지하려고 하는 동안, 조심스럽게 백혈구의 고리를 수집하고, 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포를 전송한다. 10%의 열과 활성화된 FBS를 세포에 보충한 멸균 RPMI 배지 10밀리리터를 첨가한 다음, 500회 G와 섭씨 4도에서 5분간 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 적혈구 리시스로 진행합니다.
옵션 B를 사용하여 세포를 분리하기 위해, 세포 스트레이너를 통해 소화된 조직을 통과한 후 세포 현탁액의 결과에서 원심분리한 후, 콜당 35%의 동소닉및 RPMI 배지의 8밀리리터로 펠릿을 재보중단하고 세포를 15밀리리터 튜브로 이송한다. 중간 가속과 최소 휴식과 실온에서 10 분 동안 940 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 흡혈구 또는 파이펫 보이를 사용하여 10 %의 열과 활성화 된 FBS로 보충 된 RPMI 매체의 14 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하기 전에 주체를 주의 깊게 흡수합니다.
원심 분리는 500 시간 G와 섭씨 4도에서 5 분 동안 다시 샘플을 원심한 다음 포부로 상퍼를 버리고 적혈구 용액으로 진행합니다. 적혈구를 용해하려면 X 적혈구 용액 1개 중 3밀리리터로 샘플을 재연한 다음 실온에서 3분 동안 배양한 다음, 10밀리리터의 PBS를 샘플에 추가하여 반응을 중지합니다. 상퍼를 폐기한 후 5분 동안 400회 G의 원심분리기를 추가하고, PBS의 10밀리리터를 추가하고, 센트로푸게이션을 반복합니다.
10%의 열 비활성화 FBS로 보충된 RPMI 매체의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한 다음 멸균 70 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 세포를 세고 나서 PBS의 100마이크로리터에서 세포 현탁액의 농도를 1~200만 세포로 조정하고 염색 및 팩 분석을 진행한다. 자궁그룹 1일ILC는 종래의 NK 세포, 조직 상주 NK 세포 및 1개의 IlC를 포함하고 생활과 임신 도중 그들의 백분율을 변화시다.
이러한 서브세트는 빛을 분산시키는 능력에 세포를 먼저 게이팅한 다음 단일 구매 가능한 CD 45 양성 CD 3개의 음수 CD 19 음성 세포를 분리한 다음 NK 1.1 및 NKP 46 양성 그룹 1 IlC를 식별하여 유동 세포측정을 사용하여 구별될 수 있다. 그룹 1 IlC 내에서, CD49A 음의 EM 양성은 종래의 NK 세포이다. CD49A 양성 엠스 양성 세포는 조직 상주 NK 세포이다.
및 CD49 양성 Ems 음성 세포는 그룹 하나의 자궁 ILC이다. 반대로 비장 및 자궁 림프구를 염색하여 안티 NK P46 및 항 NK 1.1 항체는 비장 림프구가 그들의 자궁 대응보다는 그들의 표면에 있는 NKP 46의 더 높은 양을 표현하는 것을 보여줍니다. 효소 조직 해리에서 표면 에피토프는 소화 매체에 사용되는 효소에 따라 변경할 수 있습니다.
예를 들어, MHC CD49 NKG2A 수용체에 대한 염색은 자유TM이 사용될 때 불량하다. 그러나 liberase DH를 통한 소화는 1611항체 클론에 의한 NKG2A 인식을 보존한다. 임신 일 8.5에서 자궁 조직 샘플에 존재하는 그룹 1 IlC의 약 6.5 %는 혈액 유래.
혈액 오염 물질은 불소 크롬으로 컨쥬게이트 된 항체를 가진 내 비탈을 통해 배제 될 수 있다. 시간 회의를 설정할 때, 당신은 마우스가 야행성 것을 고려해야합니다. 따라서 밤에짝짓기가 이루어지므로 오후에 가능한 한 늦게 설정해야합니다.
또한 여성을 선택할 때, 당신은 그들이 질 중격이없는 지 확인해야합니다. 우리는 전형적으로 세포의 외부와 세포 내의 많은 단백질을 보기 위하여 혈류 세포 측정 분석을 합니다. 우리는 또한 RNA 염기서열분석을 포함하여 유전자 발현을 연구하기 위하여 핵산 추출을 합니다.
그리고 우리는 또한 자궁 선천성 림프구 세포의 반응을 연구하기 위하여 기능적인 assays의 주위에 관리합니다.
