이 프로토콜을 사용하여 고품질 의세균 세포 용해는 광범위하게 이용 가능한 일반적인 실험실 장비를 사용하여 생산할 수 있으므로 대부분의 연구자들이 세포 없는 유전자 발현에 쉽게 접근할 수 있습니다. 프로그램 세포 자동 연무와 동결 해동 또는 동결 건조 주기를 결합하면 세포없는 유전자 발현을 위한 세균 용액 의 신속한 생산을위한 실용적이고 노동적이며 비용 효율적인 접근 법을 만들 수 있습니다. 접종 루프를 사용하여 자가 용해 E.coli 균주의 세포를 LB 한천 판에 줄이면 밀리리터 암피실린 당 50 마이크로 그램이 들어있는 다음 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오.
다음 날, 파이펫 팁을 사용하여, 한천 판에서 단일 식민지를 선택하고 암피실린과 LB 배지를 포함하는 배양 튜브에 추가합니다. 이 스타터 문화를 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 성장하십시오. 다음 날, 1 리터 Erlenmeyer 플라스크에 스타터 문화의 400 마이크로 리터를 추가 2xYTPG 매체의 400 밀리리터를 보충 50 밀리리터 암피실린 당 마이크로 그램.
300 RPM에서 흔들림으로 섭씨 37도에서 문화를 배양하십시오. 분광계와 1센티미터 길이의 광학 큐벳을 사용하여 600 나노미터의 배양 광학 밀도를 주기적으로 측정합니다. 광학 밀도가 1을 초과하면 측정 전에 배양액을 5배 희석하여 측정이 일반적인 실험실 분광광계의 선형 범위 내에 있는지 확인합니다.
5배 희석 배양물의 광학 밀도가 0.3에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 용액을 준비합니다. lysate를 준비하려면 실온에서 15 분 동안 1, 800 x g에서 원심 분리로 세포를 수확하십시오. 상체를 붓고 파이펫을 사용하여 나머지 액체를 제거합니다.
펠릿에 차가운 S30A 버퍼 45 밀리리터를 추가하고 소용돌이에 의해 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음, 튜브로 세포를 전송하기 전에 빈 50 밀리리터 원심 분리기 튜브의 무게. 세포를 다시 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
파이펫을 사용하여 나머지 슈퍼상체를 흡인합니다. 튜브의 무게를 다시 계량하고 펠릿의 무게를 얻기 위해 표시된 무게에서 빈 튜브의 무게를 뺍니다. 세포 펠릿의 모든 1 밀리그램에 대 한, 2 밀리 머 디 티 오 스 레이 톨으로 보충 감기 S30A 버퍼의 두 마이크로 리터를 추가.
그런 다음, 격렬한 소용돌이에 의해 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 펠릿이 완전히 얼릴 때까지 음수 20도 또는 음수 80도 냉동고에 배치하여 세포를 동결한 다음 실온 수조에 세포를 해동하고 2~3분 동안 적극적으로 소용돌이를 제거합니다. 300 RPM에서 흔들림으로 섭씨 37도에서 세포를 배양한 다음, 섭씨 4도에서 45분 동안 30, 000 x g의 투명한 원심분리관에서 원심분리하여 무거운 세포 이물질의 샘플을 치웁울 수 있습니다.
조심스럽게 펠릿을 방해하지 않도록주의, 파이펫과 새로운 튜브에 상체를 전송합니다. 이송된 상체가 펠릿의 물질로 오염되면 원심분리를 반복한다. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상수체를 옮김합니다.
그리고 원심분리기는 21, 000 x g 또는 탁상 원심분리기의 최대 속도에서 5분 동안 다시 한 번 증가합니다. 클리어된 자동 리세이트를 원하는 볼륨으로 알리쿼트와 사용 전까지 영하 80도에 보관합니다. 자동 lysate를 사용하여 세포 없는 유전자 발현을 위해, 얼음에 사전 혼합의 8개의 마이크로리터및 8.9 마이크로리터를 섞습니다.
8 나노 몰의 최종 농도에 DNA를 추가, 다른 필요한 시약과 물 20 마이크로 리터의 최종 볼륨을 얻을 수 있습니다. 384웰 마이크로 플레이트에 반응을 추가하고 플레이트 판독기를 사용하여 형광 시간 과정 및 끝점을 측정합니다. 플라즈마 DNA의 희석 계열을 이용한 자가용분리기를 이용한 GFP 발현은 하나의 나노몰러 DNA에서도 강한 발현을 초래한다.
시판되는 용해와 자동 lysate 사이의 GFP 표현을 비교하면 자동 lysate는 유사한 수준의 GFP를 생성했습니다. 다른 연구원에 의해 두 개의 다른 실험실에서 생산 된 lysate의 배치 사이의 가변성은 약 2 배 내에 있었다. 가장 중요한 3가지 변수는 세포 펠릿에서 버퍼링 비로, 파편없는 상수체를 옮기고 최종 반응에서 최적의 PEG 및 마그네슘 농도를 사용하는 것입니다.
추출물이 준비되면, E.coli 세포 자유 발현 시스템을 위해 개발된 기존 프로토콜의 큰 무기고를 ClpXP-매개 분해 또는 AHL 매개 쿼럼 감지와 같은 사용할 수 있다.
