우리는 아담 코스터와 도움의 의견과 토론 Altschuler와 우 실험실의 다른 모든 구성원 감사합니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 GM085442 및 CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), 그리고 웰치 재단 I-1619 (SJA)를 부여하고 I-1644 (LFW).

1. 준비 샘플 및 이미징 <ol><li> 세포 배양 <ol><li> 일상적으로 문화를 분할하고 20~70%의 합류에 유지한다. 이전 실험에 어느 날, (둘 베코의 수정 이글 중간 재료의 표 참조) DMEM에서 HeLa 세포의 성장과 10 % FBS (태아 혈청) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 실험의 날에, 분할 세포 배양 (약 50 %의 합류)에서 성장. </li><li> 몇 초 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)의 약 2 ㎖에 노출, PBS (인산염 완충 생리 식염수)으로 세포를 씻으십시오. 초과 트립신 / EDTA를 대기음 ~ 3 분 동안 실온에서 후드 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 박막에 목욕 세포를 유지. </li><li> 기계적으로 두 번 플라스크를 흔들어 혈청 보충 미디어 세포를 분리. 세포를 세어 미디어의 5,000 cells/50 μL로 희석 즉시 아니라 자동화 된 액체 처리 로봇 (30를 사용하여 384도 유리 바닥 판에 50 μL / 웰 플레이트플레이트들)은 여기에 사용됩니다. </li><li> 웰 소재 가장자리 효과를 최소화하기 위해 30 분 동안 RT에서 플레이트를 배양한다. 하룻밤 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 RT 배양, 장소 플레이트 후. </li><li> 각각의 약물은 중복으로 측정됩니다. 판은 이미 미디어를 포함에 해당 우물에 약 25 μl를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후 약물 치료에서 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 플레이트를 고정합니다. </li></ol></li><li> 염색 여기에 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체와 다른 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. <ol><li> 투과 3 분 TBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 용액 (트리스 완충 식염수)로 세포를 고정하고, TBST (트리스 완충 식염수 + 트윈 20) 3 배, 세척. 블로킹 TBST에서 5 % BSA (소 혈청 알부민) 솔루션을 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST 배, 세척. </li><li> 차 항체 dilut을TBST에서 5 % BSA에 이온 (재료의 표 참조)도 10 μL /를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 접시를 품어 후 TBST로 3 회 세척한다. </li><li> TBST에 차 항체 dilutionin 5 % BSA (재료의 표 참조)을 확인하고도 10 / μL를 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 판을 품어 후 TBST로 두 번 씻는다. </li><li> PBS에서 (재료의 표 참조) 훽스트 및 phalloidin도에 대한 희석을 준비하고 잘 10 μL /를 추가합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 접시를 품어. </li><li> 후 2 TBST 세척, 4 ° CO / N.에서 박 및 저장소의 커버 플레이트 </li></ol></li><li> 영상 카메라의 1x1 비닝로 20X 대물 렌즈를 이용하여 표면 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 480 이미지 (배 채널)의 총, 각 웰에 여섯 이미지를 획득. </li></ol> 2. 이미지 분석 다운로드 phenoripper.org에서 PhenoRipper를 설치하고 IMA의 분석을 시작 PhenoRipper를 시작GES. PhenoRipper은 TIFF를 지원, PNG 및 JPEG와 MATLAB에서 지원하는 모든 다른 형식 (현미경 소프트웨어는 일반적으로 TIFF로 수출을 지원합니다). 2.1 데이터 로딩 <ol><li> 표준 이름 / 조직 컨벤션 로딩 이미지와 연관 메타 데이터를 만들 수있는 현미경 이미지, 존재하지 않습니다 (예 : 치료의 유형으로, 즉 실험적인 주석을 잘 수 등) 워크 플로의 가장 어려운 부분입니다. (아래에 설명) 제시된 방법 중 하나를 선택합니다. <ol><li> PhenoLoader : 원하는대로 파일 이름 및 / 또는 디렉토리 구조 (예 : B16 HeLa_Drug5-DAPI.png 이미지가 잘 B16에서 않기 때문입니다 그룹의 이미지에 충분한 정보가 포함되어있는 경우 데이터를로드 반 자동이 옵션을 선택하면, 세포 처리됩니다 이 이름 지정 규칙을 사용하여, 잘 A1 또는 약 5 처리의 모든 이미지를 쉽게 분류 할 수있다) - ID가 5이고, 이미지가 핵 DAPI의 얼룩을 캡처 마약. 마법사는 것이미지 그룹과 메타 데이터를 연결하고 다음과 같이 마커를 정의하는 단계로 사용자 단계를 안내 : <ol><li> PhenoLoader 창에 액세스 할 수 있습니다 &quot;파일 구조&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 이미지 데이터 집합을 포함하는 디렉토리를 선택하려면 &quot;정의 루트 디렉토리&quot;를 클릭하십시오. 그런 다음 분석 (옵션, 빈 남아있을 수 있습니다)에 사용하지 않는 파일 (사용하지 않는 파일)를 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 실험에 사용 된 바이오 마커를 지정하고 이미지와 연결하는 &quot;정의 마커&quot;를 클릭하십시오. 구체적으로 다음 고유 생체를 식별하는 파일 이름의 부분을 선택하여 이미지 파일을 클릭합니다. 마지막으로, 각각의 바이오 마커의 이름을 입력합니다. </li><li> 각각의 이미지와 정보를 연결하는 &quot;정의 메타 데이터&quot;를 클릭하십시오. 특히, 이미지 파일을 클릭 한 다음 이미지 정보 (물론 이름 예 : &quot;B16&quot;)를 식별하는 파일 이름의 일부를 선택합니다. 창은 그룹 이름 (예 : &quot;요청 우리LL &quot;)의 이름을 입력 나타납니다. 파일 이름에서 추출 된 그룹의 구성원) 예를 들어, 잘 이름의 전체 목록 (그룹 테이블에 표시됩니다. 파일 이름에없는 추가 정보를 추가하려면 클릭&quot; (옵션) 다음 &quot;추가 그룹 이름 (예를 들어, 입력&quot;메타 그룹 추가 &quot;버튼을 클릭합니다.를 클릭&quot;약을 &quot;)와 미리 정의 된 그룹의 각 값에 대해 (예를 들어,&quot;음 &quot;)의 값을 입력합니다 (예 :&quot;탁솔 &quot;) . 추가 할 수있는 추가 그룹의 수는 제한이 없다. </li><li> 마지막으로, 메타 데이터 파일을 생성하고 분석을 계속하기 위해 &quot;만들기 Metadatafile&quot;을 클릭합니다. 메타 데이터 파일은 이전에 생성 된 경우, 상기 단계들은 직접 옵션 (아래에 설명 된 세) &quot;메타 파일&quot;을 이용하여 파일을로드함으로써 회피 될 수있다. </li></ol></li><li> 정규 표현식을 기반으로 템플릿 : 정규 표현식은 패턴과 일치하는 표준 방법입니다텍스트. 파일명 및 / 또는 디렉토리 구조는 그룹 화상에 충분한 정보를 포함하고 네이밍 컨벤션 기존 템플릿 중 하나와 일치 할 때이 옵션을 선택한다. 정규 표현식을 기반으로 사용자 정의 템플릿을 수동으로 정의하고 재사용 할 수있다. 이 고급 옵션은 정규 표현식을 잘 알고있는 사용자 만 사용해야합니다. </li><li> 메타 데이터 파일 : 궁극의 커스터마이즈에 대해이 옵션을 선택합니다. 정의하고 쉼표로 구분 된 값을 각각의 이미지에 연결된 파일 이름 및 메타 데이터를 포함하는 (CSV) 파일을로드합니다. 파일 형식의 예는 웹 사이트 (phenoripper.org)의 다운로드 부분에 유효하다. 단순히 포함 된 정보를 표시 할 인터페이스를 통해 파일을로드합니다. </li></ol></li><li> 중복을 피하기 위해 샘플링 실험 복제물을 정의 메타 데이터 필드를 선택한다. 노출 수 있습니다 (물론에 의해 예)를 그룹화, 반복 실험을 (잘 예를 들어, 모든 이미지가 비슷해야한다) 포함하는 데이터 세트에 대한비켜 성능을 제공합니다. 대부분의 경우에 임의의 부분 집합을 선택하는 기본 옵션 &quot;무작위 (모른다)&quot;을 선택하는 것이 합리적이다. </li></ol> 2.2 분석 매개 변수 설정 데이터 집합을 처리하는 데 필요한 매개 변수를 정의하는 &quot;매개 변수 설정&quot;을 클릭합니다. 정의하는 파라미터는 좌측 패널이다. 오른쪽 패널에 데이터 세트의 병합 된 샘플을 표시합니다. 서로 다른 이미지를 전환 할 왼쪽 / 오른쪽 화살표를 클릭하십시오. <ol><li> 임계 강도 : 약 화상 셀룰러 부 (아닌 배경, 비 세포 영역)를 식별하기 위해 적절한 임계 값을 선택. 임계치 PhenoRipper 의해 미리 계산되지만, 화상의 상단에 제공되는 스크롤 바를 이용하여 셀룰러 영역의 강조를 향상시키기 위해 조정될 수있다. 선택된 임계 값은 모든 이미지에서 작동하지 않는 경우, 비 세포 영역이 아닌 휴대 영역을 삭제를 포함하도록 임계 값을 낮 춥니 다. </li><li> 블록 S이지는 : 그리드에 이미지를 픽셀 단위로 적절한 블록 크기를 선택합니다. 지정된 크기의 블록은 이미지에 중첩됩니다. 20 ~ 30 블록 / 셀의 평균을 얻기 위해 블록의 크기를 조절합니다. &quot;블록 크기&quot;필드 앞의 체크 박스에 이미지 버튼을 클릭함으로써 그리드를 중첩합니다. </li><li> 선택적 매개 변수 : 자동 조정 이미지를 원하는 상대 강도와 마커를 (예를 들어, 하나의 색상이 포화 상태)를 표시 또는 마커 분석에서 제외 할 필요가있는 경우, &quot;채널의 강도를 조절&quot;옵션을 사용하지 않는 경우. 마커의 하위 집합에 휴대 영역을 식별하려면 옵션 &quot;임계 값에 사용되는 채널&quot;을 사용합니다. 다른 매개 변수의 기본 선택은 일반적으로 충분하지만, 필요한 경우, &quot;고급 분석 옵션&quot;을 사용하여 조정합니다. </li><li> 주 응용 프로그램 패널의 &quot;PhenoRip&quot;를 눌러 분석을 실행합니다. PhenoRipper 자동으로 이미지에 재발 블록 유형을 식별합니다. 표현형 프로파일이 생성됩니다그것에 상이한 블록 유형의 분획에 기초하여 각각의 이미지. </li></ol> 3. 탐색 결과 <ol><li> PhenoBrowser (그림 1)를 사용하여 이미지의 표현형 프로파일 사이의 관계를 탐구한다. PhenoBrowser 인터페이스는 4 개의 패널로 구성됩니다 : 왼쪽 상단 패널은 서로 다른 이미지 / 조건의 상대적인 유사성의 그래픽 표현 (산포도)이며, 선택된 조건의 오른쪽에 표시 샘플 이미지 및 최종 패널 (막대 차트에있는 두 개의 패널 )는 자신의 표현형 프로파일을 비교합니다. </li><li> &quot;데이터 처리&quot;메뉴를 사용하여 &quot;빈 프레임을 폐기&quot;. </li><li> 가난한 품질의 이미지를 제거 첫째, 개별 이미지는 &quot;데이터 처리&quot;메뉴에서 그룹을 해제 공부. 다음으로, 산점도의 국외자 점을 클릭하고 (예를 들어, 초점, 염색 유물) 낮은 품질의 이미지를 버린다. </li><li> 데이터를 탐색 : 필드 정의를 메타 데이터 결정하십시오비교의 기본 단위 (예를 들어 약물과 비교하기 위해, 메타 데이터 필드의 동일한 값 &quot;약물&quot;와 이미지는 함께 그룹화 될 필요가있다). &quot;그룹으로&quot;를 하나의 데이터 요소에이 메타 데이터 필드의 값이 동일한 모든 이미지를 축소. 예를 들어, 마약류 그룹은 약 당 하나의 포인트를 얻을 각 약물에서 이미지를 평균 할 것이다. 산포도 인근 (또는 먼) 포인트와 유사한 (또는 이종) 세포의 표현형을 유도 조건을 반영합니다. 해석 능력을 돕기 위해 가능한 메타 데이터를 기반으로 색상 또는 라벨 포인트 (데이터 표시 메뉴). 3D 플롯은 &quot;회전&quot;체크 박스에 왼쪽 버튼을 클릭하고 마우스를 드래그하여 클릭하여 회전 가능하다. </li><li> 직접 비교하는 두 개의 서로 다른 점을 선택합니다. 이미지 패널은 각 포인트에 대한 샘플 이미지를 표시하고, 막대 차트 패널은 그 발생 빈도 두 점 사이의 대부분의 다른 블록 형식을 보여줍니다. </li><li> C를 시작합니다블록 종류 및 실험 조건 사이의 관계의 더욱 글로벌 뷰를 제공하는 &quot;Clustergram 메뉴」로부터 lustergram. 블록의 종류와 조건을 모두 그룹화하여,이 표현은 가장 좋은 조건의 그룹 (그림 5)를 구별 세포 표현형을 강조한다. </li></ol>

<ol>
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저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 워크 플로는 빠르고 쉬운 특성과 현미경 이미지의 비교를 할 수 있습니다. 우리는 먼저이 워크 플로는 빠르게 현미경 이미지에 대한 품질 관리를 수행하여, 예를 들어 실험의 최적화를 할 수있는 방법을 보여 주었다. 다음으로, 우리는 높은 처리량 검사 데이터를 분석에 대한 가능성을 보여 주었다 : 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물에 수 있었다. 약물의 그룹?...

지난 10 년 동안 이미징 기술의 급속한 진보는 많은 실험실에게 높은 처리량 현미경을 수행 할 수있는 능력을 부여 하였다. 문제는 지금 분석 중 하나에 이미지 중 하나를 이동했다. 우리는 어떻게 비교, 특성, 그리고 일반적인 높은 처리량 영상 화면에 생성 된 복잡한 아직 미묘한 표현형의 급류를 탐험 할 수 있습니까? 이미지 분석 및 정보학 플랫폼의 숫자는 이미지의 큰 컬렉션에서 생체 정보를 추출하기위한 사용자 정교한 도구 상자 1-3을 받고 있습니다. 그러나 많은 중요한 장애물은 높은 처리량 이미지 기반 화면에서 데이터를 분석 남아있다. (그 시스템) 이미지와 알고리즘 파라미터의 미세 조정의 적절한 특성화를 선택과 관련된 어려움은 종종 특히 이미지 분석 전문 지식이없는 사용자를 위해 긴 설치 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할, 개별 셀을 식별하는 프로세스해당 화상은,이 점에서 주요 병목 현상이다. 분할은 세포 유형, 세포 밀도와 바이오 마커와 같은 실험적인 매개 변수에 매우 민감하고, 자주 큰 데이터 세트에 대한 반복 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 이미지 분석은 종종 오히려 실험 플로의 통합 부분보다 전문가에 의해 수행 독립적 단말 단계이다. 이 분석 및 실험, 분석 개발의 중요한 부분의 신속한 피드백주기를 배제한다. 여기에서 우리는 높은 처리량의 형광 현미경에 최적화 상기 어려움의 많은 것을 방지하는 다른 워크 플로우에 대해 설명합니다. 이를 위해, 우리는 PhenoRipper 4, 빠른 탐사 및 현미경 이미지 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 중요한 것은, PhenoRipper 단일 세포를 식별하려고 시도하지 않음으로써 세포 분할과 관련된 여러 가지 문제를 피할 수 있습니다. 대신, PhenoRipper 픽셀로 이미지를 분할세포 내 크기의 블록들이 포함 된 블록의 측면에서 이미지를 특징. 특히, PhenoRipper 마커 - colocalization을 기반 기능의 측면에서 블록을 프로파일 자동 교육 이미지의 가장 대표적인 유형을 차단 4 식별합니다. PhenoRipper 다음 각 블록과 가장 유사한 대표 블록 타입에 할당하고, 마지막에 포함 된 블록의 종류에 따라 이미지를 특징. 전통적인 단일 셀 기반의 접근 방식에 비해,이 방법은 최소한의 미세 조정과 전문​​ 지식을 필요로합니다. 블록 크기와 그래픽 피드백을 설정 둘 임계 강도 (이미지의 비 세포 부분을 폐기) : 이와 같이, 사용자는 두 개의 매개 변수를 설정해야합니다. 중요한 것은, 여기에 설명 된 워크 플로는 속도와 최소한의 미세 조정이 큰 시간과 신뢰성 향상을 제공 훨씬 더 큰 데이터 세트를 쉽게 확장 4를 보였다. 실제로, 우리는 발견이이 응용 프로그램바퀴벌레는 모두 크기가 4의 배수 주문하여 설치 및 실행에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. PhenoRipper의 기본 출력은 세포가 유사한 표현형을 표시하는 원인이 실험 조건의 그룹을 식별하기 위해 사용자를 가능하게하는 이미지의 유사성을 시각적으로 표시 한 것입니다. 일반적으로 발견 PhenoRipper 그룹화는 더 많은 시간이 소요되는, 세포 기반 방법 (4)에 의해 생성 된 것과 비교 &quot;생물학적 해석 가능성&quot;이. 실제로, 이것은 종종, 전형적인 96 - 웰 형광 현미경 실험을 행하는 반 시간 내에, 종래 이미지 분석 경험이없는 실험자가 자신의 실험의 성능에 대한 신뢰성있는 판독을 얻을 수 있다는 것을 의미한다. 실험은 다른 실험 조건 사이의 관계를 탐구하고 이미지 표현형에 이러한 관계의 관계를 시작할 수 있습니다. 우리는 효과를 분석하여 여기에이 워크 플로를 보여DNA와 세포 골격 마커 스테인드 HeLa 세포에 별개의 기계적인 클래스의 약물. 약물의 같은 클래스로 처리 된 세포의 이미지가 함께 그룹화하고, (그래서에 초점을 세포 밖으로 염색 유물)별로 품질의 이미지를 식별하고 잠재적으로 폐기하기가 용이하고, 아웃 라이어로 등장했다. 이 워크 플로는 이미지 기반 분석의 큰 숫자에 대한 유용하지만, 다른 방법이 잠재적으로 더 많은 정보를 될 수 분명히 많은 경우가 있습니다. 예를 들어, PhenoRipper로부터의 출력은 주로 실험 조건에 걸쳐 형광 패턴의 상대적인 비교이다. 특정 단일 세포 형질의 절대적 특성화가 (셀의 얼룩 무늬의 예 번호) 대신에 필요한 경우, 단일 세포 기반 분석이 요구된다. 그럼에도 불구하고, 심지어 이러한 유형의 상황에서, PhenoRipper이 단일 셀 표현형의 변화를 감지 할 가능성이 있으므로 분석 OPTI를위한 유용한 도구가 될 수mization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

높은 처리량 현미경의 급속한 발전에도 불구하고, 정량적 인 이미지 기반 분석은 여전히​​ 중요한 도전을 제기. 전문 영상 분석 툴의 다양한 사용할 수 있지만, 대부분의 전통적인 이미지 분석 기반의 워크 플로우 (분석 매개 변수를 미세 조정에 대한) 가파른 학습 곡선을 가지고 이미징 및 분석 간의 긴 처리 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할은 이미지의 개별 셀을 식별하는 프로세스는,이 점에서 주요 병목 현상이다. 여기에서 우리는 PhenoRipper, 신속한 분석 및 현미경 이미지의 탐험을 위해 디자인 된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 기반으로 대체, 세포 분할이없는 워크 플로우를 제시한다. 여기에 제시된 파이프 라인은 세포 배양의 면역 형광 현미경 이미지를 최적화하고 최소한의 사용자 개입이 필요합니다. 반 시간 내 PhenoRipper은 일반적인 96 - 웰 실험 데이터를 분석하고 이미지의 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 사용자 수다음 시각적으로 데이터를 탐색 자신의 실험에 품질 관리를 실시하고, 섭동에 대한 응답을 보장하고 반복 실험의 재현성을 확인합니다. 이 분석 및 분석 최적화시 매우 중요합니다 실험 사이의 신속한 피드백주기를 용이하게한다. 이 프로토콜은 단지 품질 관리를위한 제 1 패스 분석으로서 유용하지만 엔드 투 엔드 솔루션으로 사용될 수 있고, 특히 스크리닝. 여기에서 설명한 워크 플로우는 높은 처리량 스크린에 의해 생성 된 것과 같은 큰 데이터 세트로 스케일링하고, 정확하게 생물학적 시스템의 넓은 범위 표현형에 의해 그룹 실험 조건에 도시되었다. PhenoBrowser 인터페이스는 표현형 공간을 탐구하고 생물 주석에 이미지 속성을 관련하는 직관적 인 프레임 워크를 제공합니다. 종합적으로, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로 화상 스크린의 정량 분석​​을 채택하는 장벽을 낮출 것이다.

여기에서 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물이 워크 플로의 능력을 시험했다. 헬라 세포는 384 - 웰 플레이트의 30 우물에 씨앗을 품고 및 DNA / 말라 / α-tubulin에 대한 염색 하였다. 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체 및 기타 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. 웰스는 세 기계론의 클래스 (히스톤 탈 아세틸 화 효소의 억제, 미세 소관 타겟팅 및 DNA 손상) 24 ...

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Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.1K 조회수.  UT Southwestern Medical Center.  여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다. 

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

형광 현미경으로 Stromule 주파수를 시각화

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...