이 책에 이르는 작품은 GA 번호 246550에서 말라가 대학과 유럽 연합 (EU) 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 cofinanced 마리 퀴리 COFUND 프로그램 &quot;U-모바일&quot;에서 자금 지원을 받았다. 실험실에서의 작업은 VC에 NIH, USDA / NIFA, NSF, 시인, 및 BSF에서 교부금에 의해 지원됩니다

1. 단백질 발현 <ol><li> 발현 시스템의 선택 시스템, 즉, 벡터 및 특정 모델 생물 / 세포에 대한 관심의 단백질의 발현에 가장 적합한 벡터 전달 방법을 선택합니다. 우리의 분석에 가장 세포의 많은 수의 일시적 변화에 의해 달성된다 쉽게 검출 가능한 양의 시험 단백질의 발현을 필요로합니다. 식물에서, 예를 들어, 이는 유용한 전달 시스템과 같은 발현 벡터 및 아그로 이진 플라스미드를 사용하여 달성된다. </li><li> 바이너리 발현 벡터의 구축 에피토프 태그에 단독으로 또는 번역 융합 하나를 발현 벡터에 관심의 단백질 (들)의 코딩 서열 (들)을 복제합니다. 사용은 선택 발현 시스템 및 유전자 복제에 대한 표준 분자 생물학 절차에 적합한 벡터. 아그로 박테 리움 매개 유전자 전달을 위해, standa를 사용하여도, 이진 벡터를 고용하고 그들을 소개식물 조직의 후속 접종 등 EHA105으로 아그로 박테 리움 균주로 RD 프로토콜. </li><li> 식물 종의 선택 관심의 단백질 (들)로 표현 될 수있는 식물 종을 선택합니다. 아그로 박테 리움 매개 유전자 변형의 영향을 모든 식물 종은 사용할 수 있지만, 그주의, 선택의 우리의 식물 종은 쉽게 아그로 박테 리움에 매우 취약, 성장 된 담배 benthamiana이며, 쉽게 접종 큰 잎을 가지고 있습니다. </li><li> 식물 성장 긴 하루의 환경 통제 된 조건 (예를 들면, 성장 챔버) (130) (즉, 16 시간에서 냄비 (20cm가 X 20cm X 20cm)의 프로 믹스 BX와 함께 냄비에 4 주에서 6 주 동안 수행되는 하나의 식물을 성장 23 ° C에서 -150 μE m-2 S-1 등, 20 ° C에서 8 시간의 어두운)와 40-65% 상대 습도. 때때로 제조업체의 지침에 따라 상용 제품과 1.5.2 비료. 식물이 성장하면, 선택아그로 박테 리움 접종 50 X 70mm mm 또는 더 큰 크기 (이 길이 측정은 잎자루를 포함하지 않는다)를 남긴다. </li><li> 아그로 박테 리움 접종 / 적절한 항생제 (예를 들어, 100 mg의 보충 YEP 배지에서 28 ° C (1 % 펩톤 1 % 효모 추출물, 0.5 %의 NaCl)에서 하룻밤 단계 1.3에서 테스트 단백질 (들)을 표현하는 이진 구조를 숨겨 아그로 박테 리움 균주를 성장 L 스트렙토 마이신과 pPZP-RSC2 기반 벡터 24 ~ 25) 10 ㎎ / L의 리팜피신. [10 mM의 MgCl2를 2, 10 MM의 메스 (산도 5.6), 100 μM 아세토 시린 곤] 침투 버퍼 = 0.5 (600) OD, 실온에서 2 시간 동안 배양 재현 탁 1.6.2 원심 분리기 세포. 1 ML의 바늘없는 주사기를 사용하여 잎의 배축면에 문화를 침투, 공장에 연결되어있는 동안 잎이, 현장에서 접종 있습니다. 1.6.3 침투 한 후, 16 시간 130-150 &amp;의 빛 정권 하에서 72 시간 동안 식물을 성장# 181;에서 E m-2 S-1 등 23 ° 수확하기 전에 20 ° C에서 C / 8 시간의 어둠. </li><li> 프로 테오 좀 억제제의 적용 테스트 단백질 (들)은 프로 테오 경로를 통해 분해되는 개념을 지원하기 위해, 감소 또는 저하를 차단해야하는 특정 프로 테오 좀 억제제 MG132을 사용하여 28 ~ 29을 lactacystin. 네 시간 (2.1 단계 참조) 수확하기 전에, 10 μM MG132 (EMD 밀리 포어) 또는 10 μM의 lactacystin (시그마 - 알드리치) 또는과 아그로 박테 리움 접종 잎의 영역을 침투 각각의 용매, 즉, 0.1 % DMSO와 잎을 모의 치료 또는 증류수. </li></ol> 2. 무 세포 추출물의 제조 <ol><li> 잎 수확 잎의 접종 장소, 일반적으로 CA를 수확. 200-400 신선한 무게 ㎎, 액체 질소의 미세 분말로 그들을 갈기. 또한, 모든 비드 비터 (예를 들어, Biospec) 또는 치과 된 amalgamator (예를 들어, TPC 고급을 사용하여 조직을 비드 이길<html> 직접 분해 버퍼 기술) () 2.2 단계를 참조하십시오. </li><li> 단백질 추출 분해 버퍼 500 μL에 지상 조직을 배치하여 총 단백질 추출물을 준비 [50mM의 트리스 - HCL (산도 7.5), 100 mM의 NaCl을, 10 mM의 MgCl2를 2, 5 mM의 DTT, 5 MM의 아데노신 5&#39;-인산, 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치)]. 프로테아제 억제제 칵테일은 주로 세린, 시스테인, 아스파라긴산, 그리고 메탈로 영향을 미치는 26S 프로 테아을 방해하지 않습니다. 5 분 12,000 XG에서 두 개의 연속 centrifugations하여 추출물을 명확히. </li><li> 단백질 분해 반응 튜브의 미세 시간의 증가 된 기간 동안 실온에서이를 배양, 추출, 보통 20 μL 같은 부피를 전송합니다. 일반적으로, 샘플 시간 제로 및 5, 10, 15, 20, 그리고 30 분 시간 지점. SDS 젤 샘플 버퍼에 끓여 반응을 중지하고 서부 블롯을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. 면역 블 롯팅에 의해 단백질 분해 검출 <ol><li> 겔 전기 영동 3.1.1 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동하여 단백질 시료를 해결하고 표준 프로토콜 30에 따라 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 해결 electrotransfer. 3.1.2 브래드 포드 방법 (바이오 래드)를 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 레인 당 총 단백질의 50 ~ 80 μg을로드합니다. 모든 샘플이 동일하게로드되어 있는지 확인합니다. 컨트롤을로드를 들어, 약 50 kDa의 상대 전기 이동성과 주요 밴드로 마이그레이션 추정 RuBisCo 대형 체인 등 유비쿼터스 단백질 종의 농도를 비교, 그들은 쿠마시 블루 염색 젤 또는 개양귀비 빛의 S-또는 감지 할 수 있습니다 형광 SYPRO 니트로 셀룰로오스 막 루비 스테인드. </li><li> 블로킹 실온에서 1 시간 동안 TBST에서 5 % 탈지 우유 (10 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4의)으로 멤브레인을 차단. </lI&gt; <li> 차 항체 제조업체에서 권장하는 농도로 TBST 1 % 탈지 우유에 기본 안티 - 항원 항체를 희석하고 교반과 함께 4 º C에서 실온에서 1 시간 동안이나 밤새 차단 막과 부화. </li><li> 세정 막 한 번 15 분 동안 20 ㎖의 TBST에 린스 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분. </li><li> 이차 항체 제조업체에서 권장하는 TBST 1 % 탈지 우유에 말 무 퍼 옥시 데이즈 (HRP)가 결합 이차 항체 (예를 들어, 안티 - 토끼 IgG의)를 희석하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 막에 품어. </li><li> 검출 단계 3.4에 설명 된대로 다시 멤브레인을 씻어. TBST에서 최종 헹굼 후, 가장 일반적으로 ECL 키트를 사용하여, HRP를 화학 발광 기질과 관심 단백질을 가시화. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 분석은 식물 조직에서 시험 단백질의 발현에 의존하고, 따라서, 잠재적 인 프로 테오 분해 과정은 분명히 생체 조직 내에서 이미 발생한다. 우리는 제로 샘플은 초기 기준점으로서의 시간만을 추출한 그러나 단백질 불안정화를 분석 실험. 따라서, 우리는 세포가없는 분석으로 정의합니다. 이 분석의 성공에 대한 한 가지 중요한 측면은 시험 단백질 (들)이 생성 될 것이다?...

ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 경로는 다른 사람의 사이에서 전사 조절, 세포주기의 진행과 신호 전달 수용체 하향 조절 또는 엔도 시토 시스, 1-4을 처리하는 등 다양한 생물학적 반응의 제어를위한 광범위한 메커니즘으로 부상하고있다. 이 경로에서, 목적 단백질은 제 유비퀴틴 활성화 효소 E1에 thiolester 결합을 통해 부착하고 유비퀴틴 접합 효소 E2의 시스테인 아미노산 잔기에 옭되는 잔기를 유비퀴틴로 태그되며 마지막으로, E2는 유비퀴틴 리가 제 E3와 상호 작용 , 단백질 기질의 polyubiquitination 결과. 궁극적으로, polyubiquitinated 단백질은 26S 프로 테아 좀에 의해 인식 저하된다. 이 메커니즘에서, E3 효소는 기질을 지정하고 ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 주요 구성 요소를 규정하는 역할을한다. E3 리가 제의 예 RING 도메인 리가 제로서, 또는 multisubunit의 SCF (S의 일부로서 역할을 할 수 독립적이러한 F-상자 도메인 리가 제와 같은 kp1/Cullin/F-box 단백질) 복잡한. SCF-매개 프로 테오 분해 경로는 전사, 세포주기, 신호 전달 5-10 많은 다른 주요 세포 기능의 조절에 관여하고 있습니다. 세포 과정의 조절에 이러한 중요한 역할 외에, UPS는 많은 식물 병원균 상호 작용에 중앙 무대 걸립니다. 예를 들어, 증거가 증가하고 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 등 여러 가지 식물 병원균, 감염 과정 (11)를 용이하게하기위한 호스트 UPS에 의존하는 것이 좋습니다. 아그로 박테 리움은 자연의 호스트를 나타내는 식물에 종양 성장을 이끌어, 또한 인간의 세포 (12, 13)에 곰팡이 1,2에서, 다른 진핵 생물의 넓은 범위를 변환 할 수 있습니다. 그 감염시, 아그로 박테 리움은 숙주 세포 12-13으로 DNA 요소 (T-DNA) 및 여러 독성 (비르) 단백질을 보냅니다. 이러한 단백질 중 하나는 VirF, 발견 된 첫 번째 F-박스 단백질원핵 유전체 (14)에 의해 부호화된다. SCF 유비퀴틴 리가 아제 단지, VirF, 그 기능 호스트 상동 VBF (15)의 한 부분으로, 아마도 VirE2, 그 부속 세균 및 호스트 단백질에서 침입하는 세균의 T-DNA의 uncoating을 용이하게 UPS 매개 단백질 분해를 통해 아그로 박테 리움 감염을 촉진 및 VIP1 각각 16, 17. 흥미롭게도, VirF 등 많은 F-박스 단백질은, 때문에 autoubiquitination 활동 18, 19 또는 F-박스 단백질이 기판 20-23 역할을 할 수있는 다른 E3의 리가 제에 의해 매개되는 자신의 단백질 분해, 본질적으로 불안정하다. F-박스 단백질, 다른 유비퀴틴 리가 제, 및 / 또는 기판의 생화학 활동을 연구 할 때, 프로 테오 저하위한 간단하고 신뢰성있는 분석을 사용하는 것이 매우 유용 할 것이다. 여기에서 우리는 세포의 단백질 안정성 분석을위한 하나의 프로토콜을 설명없는 시스템입니다. 이 분석에서, UPS 기판의 안정성은 무 세포계에서 이러한 F-박스 단백질로서 프로 테오 열화 통로의 필수 성분 중 하나의 존재 또는 부재 하에서 분석된다. 일반적으로, 우리는 이러한 조직에서 무 세포 추출물을 준비하고 웨스턴 블로 팅에 의해 관심의 단백질 (들)의 양을 모니터링, 식물 조직에서 테스트 된 단백질 (들)을 표현한다. 단백질 분해의 UPS 의존 메커니즘은 특정 프로 테오 좀 억제제 및 / 또는 SCF 성분 Cullin의 우성 음성 형태의 동시 발현을 사용의 포함에 의해 증명된다. 우리 VBF 15 F-박스 단백질에 의해 아라비돕시스 VIP1 17 단백질의 프로 테오 저하하여이 분석을 예시하는 반면, 그것은 임의의 다른 프로 테오 기판의 안정성을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

단백질 분해에 대한 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로는 거의 모든 진핵 생물의 세포 기능의 다양한 스펙트럼의 규제를위한 가장 중요한 메커니즘 중 하나로 떠오르고있다. 구체적으로, 식물에서, 프로 테아 좀의 ubiquitin/26S 시스템 (UPS)의 단백질 분해를 조절하고 면역 반응, 개발 및 프로그래밍 된 세포 사멸을 포함한 공정의 넓은 범위의 발전에 크게 기여한다. 또한, 증가하는 증거는 아그로 박테 리움 등 다양한 식물 병원균, 식물 병원균 상호 작용에있는 UPS의 중요성을 강조하고, 효율적인 감염 호스트 UPS를 이용하는 것이 좋습니다. UPS의 기질 특이성은 E1과 협력 작용 및 E2가 그들에게 유비퀴틴 분자 체인을 부착하여 열화로 향하는 특정 단백질 분자를 인식하고 표시하는 리가 제 E3 유비퀴틴 리가 제에 의해 달성된다. E3의 리가 제의 하나의 클래스가 SCF입니다 (Skp1 / C특히 UPS 기판을 인식하고 자사의 F-박스 단백질 구성 요소를 통해 유비퀴틴을 위해 그 (것)들을 대상으로 율린 / F 상자 단백질) 복잡한. 그 생물학적 과정에서 UPS의 잠재적 인 역할을 조사하기 위해, UPS 매개 단백질 분해에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 분석을 고안하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 식물 세포가없는 시스템을 사용하여 하나의 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 F-박스 단백질 기판의 상호 작용에 특별한 중점을두고, 다양한 세포 과정의 조절 단백질 분해의 역할의 연구에 적용 할 수 있습니다.

Zaltsman 등. 17에서 적응 그림 1은 세포가없는 시스템에서 프로 테오 저하의 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 특히, 우리는 N.의 SCF VBF 경로를 통해 VBF F-박스 단백질에 의한 식물 방어 관련 단백질 VIP1의 불안정을 보여 benthamiana. 애기 VBF 및 HA-태그 VIP1 (HA-VIP1) 단백질을 일시적으로 동시 발현하고, 표현 잎의 추출물 내의 HA-VIP1 콘?...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 &quot;태그&quot;봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K 조회수.  Stony Brook University, State University of New York.  표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다. 

비디오: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

셀없는 매체 Wolbachia을 유지

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

연구

생물학

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

탈세포화(decellularization)를 통한 골격근 지방 침투의 정량화

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

저자 스포트라이트: 골격근 지방 침투의 탈세포화 기반 정량화  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.