This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

기생충 세포 배양 1. 준비, 기생충 펠렛의 컬렉션 <ol><li> 1 L에 RPMI-1640 분말 10g, 겐타 마이신 황산염 66 ㎎, 2g 중탄산 나트륨, 5.9 g의 HEPES 완충액, 50 mg을 하이포크 산틴 3.8 g의 덱 스트로스를 추가하여 RPMI-1640-HEPES 매체를 준비 멸균 DH 2 O. 1 L의 증류수 모든 분말이 용해 될 때까지 테이블 마그네틱 교반기를 사용하여 혼합. 0.22 μm의 필터를 사용하여 미디어의 미세 여과를 수행합니다. 멸균 병에 미디어를 보관합니다. </li><li> 감염되지 않은 (신선한) 워시 RPMI를 사용하여 A + 적혈구를 입력합니다. 적혈구 용적률 5 % (9.5 ㎖의 RPMI + 10 % 인간 혈청 세척 신선한 적혈구 0.5 ml)로 준비한다. </li><li> 15 % 인간 혈청 + RPMI (인간 혈청 15 ㎖의 RPMI의 85 ml)을 기생충의 재배를 시작합니다. 10 % 인간 혈청 및 RPMI (인간 혈청 10 ㎖와 RPMI 90 ml)을 적혈구에서 기생충의 배양을 계속합니다. </li><li> 문화 P. 원충 (3D7 및 FCR-3 균주) 유형5 % 적혈구 용적률 20 %의 기생충 배양 접시에서 또는 75cm 3 문화 플라스크에서 A + 인간의 적혈구. 트레와 젠슨 촛불 항아리 (26)의 방법에 따라 체외에서 배양을 유지한다. 또는, 문화가 9.5 %의 CO 2 및 3.4 % N2 가스 유지 37 ° C에서 인큐베이터에 유지한다. 문화 P. 원충은 RPMI-1640 배지 HEPES 10 % 인간 혈청. </li><li> P. 동기화 65 % 퍼콜 문화 (퍼콜 + 인간 혈청이없는 RPMI-1640의 35 ㎖를 65 ㎖)에 추가하여 원충 문화 (27)을 집중한다. </li><li> 3 층 결과 5 분 2500 XG에서 퍼콜와 문화 농축 원심 분리기. 조심스럽게, 전송 피펫을 사용하여 무균 조건 (27)에서 별도의 튜브에 중간 계층 전송에서 schizonts을 격리 할 것. </li><li> 5 분 7500 XG에서 원심 분리하여 초과 퍼콜을 제거하기 위해 두 번 10 % 인간 혈청 + RPMI-1640와 고립 된 문화를 씻으십시오. 디상층 액을 무균 조건 (27)에서 각각의 시간을 scard. </li><li> 동기화 된 피를 배양 계속 10 % 인간 혈청 + 27 RPMI-1640 열대열 schizonts. </li><li> 10 mM 트리스 pH를 8.8로 변형체에게 -infected 적혈구를 치료하고 15 분 23 15000 XG에 원심 분리하여 schizonts를 수집합니다. 펠릿에 단백질 분해 효소 억제제 (아프로 티닌) 5 ㎕를 첨가 한 다음 -70 ℃에서 저장 기생충 펠렛. 단백질 추출, 게놈 DNA를 분리하고 RNA 분리에 대한 기생충 펠렛을 사용합니다. </li></ol> 2. 플라스미드 벡터를 준비 <ol><li> P.에서 게놈 DNA를 분리 약 20 %의 기생충의 문화에서 준비 원충 schizont 펠렛. </li><li> , microcentrifuge 관에서 펠렛하여 pH 7.6의 10 mM이 트리스 - 염산, 50 mM의 EDTA의 pH 8.0, 0.1 % SDS 1 ㎎ / ㎖ 프로 테 K, 600 μl를 추가 26 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여 펠렛을 균질화. 주사기 충전 대체펠릿 혼합물 microcentrifuge 관으로 20 배와 비우기. 50 ° C의 물을 욕조에 튜브를 포함하는 균질의 O / N을 품어. </li><li> P + C 600 μL (페놀의 300 μL 클로로포름 300 μL) 균질 펠릿에 추가하여 클로로포름 (P + C) 추출 - 페놀을 수행합니다. 캡 튜브는 단단하고 튜브 종단을 반전시킴으로써, 혼합물을 격렬하게 흔들어. 2 분 동안 14,000 XG 및 원심 분리기 튜브 새로운 microcentrifuge 관에 마이크로 피펫을 이용하여 상부 수용액을 모은다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 단계 2.1.2에서 새 튜브에 수성층에 클로로포름 600 μl를 추가합니다. 2 분 동안 14,000 XG에 10 초 원심 분리 용 튜브를 소용돌이. 마이크로 피펫으로 상부 수층을 측정 새로운 마이크로 원심 튜브로 옮긴다. </li><li> 수성 누워 (수층 300 μL를 5 M 아세트산 나트륨 pH를 이소프로판올 5.5 + 330 μL의 30 μL를 추가하는 경우) 5 M 아세트산 나트륨 pH가 5.5, 0.1 부피의 이소프로판올을 추가 한 권단계 2.1.3에서 어. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션 튜브. </li><li> DNA 펠렛을 침전을 10 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 DNA로부터 과도한 소금을 제거하기 위해 70 % 에탄올 100 ㎕ (에탄올 70 μL와 DH 2 O 30 μL)와 펠렛을 씻는다. -20 ° C에서 DH 2 O 50 μL에 보관 된 DNA. </li><li> P.의 증폭을 위해 수동으로 앞으로 디자인과 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 역 또는 표 2에 나타낸 바와 같이 원충 유전자 PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 및 PF3D7_0114100 이전 프로테옴 연구 발현 플라스미드 pT7CFE1-CHis의 다중 클로닝 사이트 내로 유전자 서열의 복제를 허용하기 위해 적절한 제한 부위를 가진 (16, 18)에서 식별. </li><li> 추가하여 50 ㎕의 반응 혼합물을 만들기; 고립 P. 5 μL 원충 게놈 DNA, 10 배 버퍼의 5 μL,의 MgCl 2의 5μL, 정방향 프라이머의 1.5 μL, 1.5 μL역방향 프라이머, T7 DNA 중합 효소 0.5 μL와 DH 2 O 31.5 μL 및 변성 8 분 동안 94 ° C에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는, 연장 된 1 분 30 초 동안 50 ° C 및도 9를 72 ° C 표 1에 기재된 유전자를 증폭하기위한 어닐링과 탈 변성 분. </li><li> 1 % 아가 로스 겔 (1 g의 아가 및 트리스 아세테이트 100 ml의 EDTA (TAE) 버퍼) (32)에 별도의 PCR 제품. </li><li> , 아가 로스 겔로부터 PCR 증폭 된 DNA 밴드를 잘라 DNA 겔 추출 스핀 컬럼에서 DNA를 함유하는 겔 슬라이스를 넣고 5 분 동안 -20 ℃에서 동결. 5 분 동안 14,000 XG에서 냉동 젤 슬라이스와 원심 분리기에 이소프로판올 100 μl를 추가합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 수성 관류 단계 2.5에서 포집 관에서 필터링을 측정하고 새로운 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 14,000 XG에서 5 M 아세트산 나트륨과 원심 분리기의 0.1 권을 추가합니다. 뜨는을 취소하고 토륨하는 DH 2의 O를 10 μl를 추가전자 DNA 펠릿. </li><li> 플라스미드 3 μL 각 튜브 PCR 유전자 제품의 5 μl를 첨가하여 두 가지 별개의 튜브 pT7CFE1-CHis 발현 벡터 및 (2.6)로 정제하여 DNA 단편 다이제스트. 각 튜브에 특정 제한 효소 1 μL, 반응 버퍼의 2 μL와 DH 2 O 14 μl를 추가 </li><li> 소화 플라스미드의 3 μL, 소화 DNA 단편의 5 μL, 10 배 리가 버퍼의 2 μL, 리가의 1 μL 및 microcentrifuge 관에서 DH 2 O 9 μl를 추가합니다. 12 ° CO / N에 품어. </li><li> pH가 5.5 에탄올 2 부피에서 3 M 아세트산 나트륨 0.1 부피 추가 단계 2.14에서 튜브 (검색 결찰 튜브 부피 인 경우 20 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 에탄올 + 44 μL의 2 μL를 추가). 잘 혼합하고 15 분 동안 -20 ° C에서 품어. </li><li> 15 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 마이크로 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올 (T)의 100 μl를 추가단계 2.10에서 펠렛 오. 5 분 동안 14,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다. DNA 펠릿에 뉴 클레아없는 물 10 μl를 추가합니다. </li></ol> 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템에서 사용하기 3. 단백질 발현 <ol><li> 재조합 pT7CFE1-CHis 플라스미드 DNA의 2 μL, 5 배의 전사 버퍼 4 μL, NTP 믹스의 4 μL, T7 RNA 중합 효소의 2 μL 및 뉴 클레아없는 물 8 μL 2 단계를 측정하여 전사 혼합물의 20 μl를 준비 DNA 템플릿을 사용하여 체외 단백질 발현에 인간. 마이크로 원심 튜브에 구성 요소를 혼합하고 수조에서 30 ° C에서 75 분 동안 배양한다. </li><li> 전사 액 2 μL를 취하여 헬라 세포 용 해물 12.5 μL, 부속 단백질 2.5 μL, 염 용액 1 ㎕를, 아미노산의 0.5 μL -Met, 아미노산의 0.5 μl를 함유 번역 액 23 μL에 추가 -Leu, 181]의 RNAse 억제제 (L), 에너지 믹스 1.25 μL 및 클레아없는 물 3.75 μL. </li><li> 90 분 동안 30 ° C에서 3.2 단계에서 번역 된 혼합물을 인큐베이션. 스토어 -20 ° C에서 제품을 번역했다. </li><li> 1 단계 재조합 pT7CFE1-CHis 플라스미드 DNA의 3 μL, 클레아없는 물 2 μL, 반응 혼합물의 5 μL, 헬라 해물 12.5 μL 소품 단백질, 2.5 μl를 첨가하여 전사 및 번역 혼합물 25 μl를 준비 DNA 템플릿에 대한 인간의 결합 IVT 단백질 발현. </li><li> 30 ° C에서 90 분 내지 6에 대한 3.4 단계에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 번역 제품에서 보관 -20 ° C. </li></ol> 표현 (4) 재조합 단백질의 정제 <ol><li> 정화 혼합물 100 ㎕를 만들기 위해 번역 제품의 25 μL에 1X 정화 버퍼의 75 μl를 추가합니다. </li><li> 정화 mixt 100 ㎕에 니켈 킬레이트 수지 100 μl를 추가URE. 워시 니켈 수지를 두 번 DH 2 O의 300 μL와 결합 버퍼의 300 μl를 추가하여. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 1 분 동안 14,000 XG에서 수지와 원심 분리기를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 단계에서 니켈 킬레이트 수지의 4.2-100 μl를 정화 혼합물의 100 μL를 추가하고 실온에서 60 분 동안 혼합물을 품어. </li><li> 1 분 14,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기와 &quot;를 통해 흐름&quot;으로 표시 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 1X 세척 버퍼 100 ㎕ (20 mM의 이미 다졸, 250의 pH 8에 mM의의 NaH 2 PO 4, 2.5 M의 NaCl과 DH 2 O)와 세척 수지. 1 분 14,000 XG에 원심 분리기와 &quot;세탁&quot;이라는 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 단계를 반복 4.5 배. </li><li> 1X 용출 완충액 100 μL 추가 (PH 8.0, 100 mM의 이미 다졸, 250 mM의 나트륨 2 PO 4, 2.5M 염화나트륨 및 DH 2 O)를 수지와 ​​15 분 동안 배양한다. 1 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 두 번 용출 단계를 수행합니다. 각각의시간은 &quot;용출액&quot;신선한의 microcentrifuge 튜브 및 레이블에 상층 액을 수집합니다. </li><li> 4.5 단계에 설명 된대로 용출 후, 두 번 수지를 씻는다. 스토어는 -20 ° C 이하에서를 통해, 세척 및 용출 샘플 흐름. 수지는 4 ° C에서 저장해야합니다. SDS-PAGE 및 면역 분석을위한 각 샘플의 30 μl를 사용합니다. </li></ol> 5. 쿠마 (브래드 포드) 단백질 분석 (34) <ol><li> 농도 표준 소 혈청 알부민 (BSA) 용액 준비 20 ㎍ / ㎖를 40 ㎍ / ㎖ (BSA 20 μL를 혼합 (BSA (2 ㎎ / ㎖) 및 DH 2 O 90 μL의 10 μL를 혼합) (2 mg의 / ml) 및 DH 2 O) 80 μL, 60 ㎍ / ㎖ ((2 mg의 BSA (2 ㎎ / ㎖) 및 DH 2 O) 70 μL, 80 ㎍ / ㎖ (BSA 40 μL를 혼합하여 30 μL를 혼합 / ml) 및 DH 2 O) 60 μL를 100 μg의 / ㎖ (BSA (2 ㎎ / ㎖) 50 μL 및 DH 2 O) 50 μL, 160 ㎍ / ㎖ (BSA의 80 μL를 혼합하여 혼합 (2 mg의 / ml) 및 DH 20 μL2 O), 200 μg의 / ㎖ (100 ㎕ BSA (2 ㎎ / ㎖). </li><li> 측정 단계 4.7에서 흐르는, 세척 및 용출 샘플의 5 μL. DH 2 O의 95 μl를 추가 </li><li> 단계 5.1 및 5.2의 혼합물에 쿠마 푸른 시약의 5​​ ML을 추가합니다. 초 후 실온에서 20 분 동안 품어 10 파라 필름과 소용돌이 튜브를 커버. </li><li> 분광 광도계를 사용하여, 단계 5.3에서 단백질 튜브 650 nm의 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. OD 판독 대 플롯 농도는 단백질 농도를 결정한다 (34). </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅 <ol><li> P.에서 schizont 추출물의 5 μl를 추가 원충은 대장균 2㎕의 재조합 Rhop-3 단백질 (31)을 발현하는 재조합 단백질의 5 μL 튜브를 분리하는 친화 법을 이용 2 단계 및 시험 관내 인간 발현 시스템에서 1 단계와 단백질 제품의 10 μL로 정제하여 표현. </li&gt; <li> 용해 된 단백질 시료를 만들기 위해 20 μL의 최종 볼륨에 대한 각각의 튜브에 전기 영동 샘플 버퍼 포함 머 캅토 에탄올을 추가합니다. 2 분 동안 튜브를 끓인다. </li><li> 단백질을 분리하기 위해 10 % SDS-PAGE 젤 상에 가용화 된 단백질 시료를 적재. </li><li> 2 시간 반 건조 웨스턴 블로 팅 챔버에서 젤 당 35mA 전류에서 전기 영동에 의해 니트로 셀룰로오스 종이 (NCP)에 대한 SDS-PAGE 젤에서 분리 된 단백질을 전송합니다. </li><li> 2 % 무 지방 우유와 함께 전송 다음 블록의 NCP. </li><li> 품어 1 희석 한 다음 클론 항체와의 NCP를 차단 : 웨스턴 블롯을 수행하기 위해 2 % 우유 (100); 토끼 항체 (P)에 대한 특정 # 676 (21) 원충 merozoite rhoptries, P. 20 특정 마우스 항체 yoelii 및 P. 피에 대한 특정 berghei의 merozoite의 rhoptries, 항혈청의 # 685 마우어 특정 원충 parasitophorous 공포 단백질, 세라 (세린 풍부한 항원) (22)와 항체217;의 갈라진 단백질 PfMC-2TM (28). </li><li> 1도의 NCP을 품어 : 100 희석 정상 마우스와 토끼의 혈청 및 SP2 골수종 세포에서 소비 배양 상청 (SCS)와 같은 부정적인 컨트롤을. </li><li> 4 ºC O / N에서 항체와 컨트롤의 NCP를 품어. </li><li> 오 씻을의 NCP 배는 버퍼와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 종 특정 차 항체와의 NCP를 품어 1 희석 : 2 % 우유 (1000). </li><li> 오 버퍼와 세척의 NCP 4 배. 인큐베이션은 발색 용액의 NCP 세정 + B (용액 A : 버퍼 1X 블롯 50ml를 추가하고 H 2 O (2)의 30 μL; 용액 B는 메탄올 10 ㎖ 및 3- 클로로 나프톨 30mg을 추가) 30 어둠 속에서 분. 비색 웨스턴 블롯 결과를 분석합니다. </li></ol>

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Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

체외 인간 세포 무료 발현 시스템 및 정제에 두 단계를 사용하여 단백질을 성공적으로 표현 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 성공적으로 증폭 및 pT7CFE-CHis 플라스미드 벡터로 유전자의 복제; 2) 30 ℃로 RNA를 전사; 의 RNAse 억제제의 존재하에 30 ℃에서 단백질 3) 번역; 4) 폴리 클로 날 및 모노클로 날 항체를 사용하여 수지 Ni 및 5로 코팅 된 비드)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 이용하여 ?...

말라리아 연구에서 원핵 또는 진핵 세포 기반 시스템을 사용하여 면역 원성 단백질의 발현 도전 남아있다. 변형체 게놈과 알 수없는 포스트 번역 메커니즘 14,7의 AT의 풍요 로움은 항체 생산 및 백신 연구에 적절하게 접어 면역 원성 단백질을 획득과 관련된 어려움에 기여한다. 대장균 등의 원핵 시스템은 재조합 단백질 발현을 위해 사용되어왔다. 원핵 생물 시스템은, 효과적인 저렴한 비용으로 재조합 단백질의 높은 수율을 생산 여러 클로닝 벡터를 가지고있다. E. 호스트 대장균 세포는 변형이 용이하고 신속하게 세포 성장. 그러나, 이러한 시스템은 원핵 아미노산 치환, 번역 후 변형, 봉입체 (24) 내의 오염, 제품 및 이종 재조합 단백질의 축적의 위험 부족 등 한계가있다. 안에Mehlin 등의 알에 의해 연구. (2006) 1000 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 표현 하였다. 발현 된 단백질의 약 7 %가 용해 (14)이었다. 관찰 불용성 유전자의 바이어스 특성 및 풍부한 게놈 14의 변형체로 이상적으로 사용되는 코돈 고주파 때문이다. 이 문제를 극복하기위한 대안적인 전략은 플라스미드 또는 희귀 코돈 또는 3 주파수 일치 코돈 인식의 tRNA를 포함하는 숙주 세포를 사용하여 개발되었다. 비록 이러한 최적화를 수행 한 후, 단백질의 매우 작은 부분, 수용성 활성 면역 원성 및 14로 표현된다. 무 세포 발현 시스템은 리보솜, 개시 요인, 신장 요인 (번역 인자)의 tRNA 및 아미노 아실 tRNA의 합성 효소 등의 전사 및 번역에 필요한 모든 구성 요소가 포함되어 있습니다. 두 전사 및 번역 반응은 한 단계 절차 11,29에 결합된다. transcrimRNA의 적당량은 상이한 튜브 11,29 병진 기계와 함께 배양하기 전에 ption 반응 관에서 수행된다. 이러한 방법 변형체 SP. 단백질 발현에 성공하지만, 주요 단점은 약 22 시간이며 29 단백질 발현을위한 시간의 길이이다. 또한, 프로토콜들 (29)에 포함 용품의 고가 성분 제제에서 노동 집약적 파쇄의 제제와의 불일치는, 이러한 시스템은 얻기 어려운 만든다. 무 세포 발현 시스템의 개발을위한 연구의 주요 초점은 빠른 유전자 변형, 높은 농도 및 정직 해물 준비 1 빠른 수율 등의 요인에 따라 달라집니다. 효모, 포유 동물 세포주, 배큘로 바이러스 매개 된 발현 시스템, 테트라 하이 메나의 thermophilia, Dictyostelium의 discoideum 기생 발현 시스템 SU 진핵 시스템리 슈만 편모충 같은 CH 재조합 단백질 발현 7에 사용되어왔다. 진핵 시스템 계통 관계를 공유하고, 따라서 또한 글리코 실화, 아 실화, 이황화 결합 형성, 샤페론 상호 작용, 단백질 분해 및 서브 셀룰러 구획화 등의 특성을 공유한다. 진핵 생물의 단백질 분비 이벤트는 축적을 방지하고 발현 시스템 (13)에 대한 독성을 감소시킨다. 그들은 대규모 단백질 발현 및 높은 수율을 얻는 4에 적합한 효모 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 두 P. 원충의 단백질 PfCP-29과 Pvs25는 효모 시스템 (4)를 사용하여 제작되었다. 그러나, 대부분의 단백질의 합성에 중요한 결점이 불규칙 N과 O 글리코 실화 패턴, 부적절한 폴딩과 그 나라의 형태 4에서 단백질을 절단했다. 재조합 단백질의 합성을위한 포유 동물 세포의 사용은 노동 집약적이며 expen되고안정적인 재조합 세포주 4 유지 시브. 따라서, 포유 동물 세포는 단백질 시그널링 단백질 상호 작용 및 기생충 호스트 상호 작용 분석을 위해 한정되고, 또한 DNA 백신 4를 테스트. 본원에 기술 된 인간 DNA와 mRNA의 생체 외 단백질 발현 무 세포계는 3 시간에 단백질을 발현하는 헬라 세포 유래 포유류 기반 시스템이다. 단백질 식별 및 정화를 촉진 C- 말단 태그를 pT7CFE1-cHis 발현 벡터를 사용하여 표현했다. 헬라 기반 시스템함으로써 번역 시스템의 효율 향상, 번역 개시 인자 및 번역 조절로 보충된다. 단백질은 빠르게 번역 스크리닝 검증 및 다양한 면역 및 구조 (15) 애플리케이션에서 사용하기 위해 처리 될 수있다. 밀 배아와 토끼 망상과 같은 진핵 세포 - 표현의 자유 시스템은 현재 VAR의 표현에 사용되는변형체 단백질 11,29 포함 빚을내는 진핵 세포 단백질. 또한, E. 대장균 계 무 세포 시스템은 또한 진핵 단백질 발현을 위해 사용된다 (11). 표 1은 시스템의 기능뿐만 아니라 단백질 발현 시스템을 사용의 용이성을 비교함으로써 다른 무 세포 발현 시스템을 요약 한 것이다. 다른 사람들에 비해 인간의 무 세포계 포스트 공동 번역 후 변형을 수행 할 수있는 능력을 보유하고 덜 비싸다. 코돈 최적화가 가능하며, 모든 반응은 3 시간으로 수행 될 수있다. 헬라 시스템은 실험실 설정에서 단백질 합성을위한 번역 시스템에 이상적이다. 다른 무 세포 시스템에 비해 인간의 무 세포 발현 시스템의 큰 장점은 다른 기관 및 조직에서 유래 된 여러 세포주의 이용이다. 셀 무료 시스템의 여러 종류는 셀 라인에 따라 설계 할 수있다. 추출물포유 동물 세포 유래의 S는 다른 무 세포 발현 시스템보다 많은 단백질을 합성하기 위해 더 높은 효율을 갖는다. 이 무 세포 발현 시스템은 또한 마이크로 어레이 (30)로 진단 및 단백질 특성 애플리케이션에 사용될 수있다. 인기 인 HeLa 세포주는 가장 널리 단백질 33의 발현을 수행하기 위해 사용된다. 된 HeLa 세포주에서 소포체는 번역 후 변형 글리코 실화 활성 (33)의 부재를 초래 낙후이다. 그러나,이 시스템은 또한 글리코 실화 변형체 포스트 번역 변형 29 부족으로 변형체 단백질 합성에 유리할 것으로 생각된다. 헬라 세포 자유로운 전사 번역 프로토콜 저렴 수행하기 쉬운 단백질 정제 및 하류 어플리케이션을위한 준비, 90 분으로 표현 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

말라리아는 중요한 글로벌 이환율과 사망률을 발생합니다. 어떤 일상적인 백신은 현재 사용할 수 없습니다. 백신의 부족에 대한 주요한 이유 중 하나는 적합한 백신 후보를 식별하는 도전이다. 말라리아 단백질은 원핵 생물과 진핵 세포 기반 발현 시스템이 제대로 감소 면역 원성에 이르는 부적절한 폴딩, 일반적으로 불용성 당화 및 겪게된다 사용하여 표현. 밀 배아, 토끼 망상 적혈구 용 해물 및 대장균 파쇄 무 세포 발현 시스템은 현재 말라리아 단백질의 발현을 위해 사용된다. 그러나, 발현 시간과 단백질의 부적절한 당화의 길이는 여전히 과제로 남아. 우리는 &quot;시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템&quot;이라 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 시험 관내에서 변형체 단백질의 발현을 보여준다. 2 헬라 세포 기반 표현의 자유 시스템은 75 분, transcrib의 3 μL에서의 mRNA를 전사ED의 mRNA는 90 분에 단백질을 변환하기에 충분하다. 1 단계의 발현 시스템은 전사 및 번역에 결합 발현 시스템이고; 전사 및 공동 번역은 3 시간에 발생합니다. 프로세스는 추가적인 에너지를 제공하여 6 시간 동안 연장 될 수있다. 2 단계 발현 시스템에서 mRNA를 먼저 전사 된 후 단백질 발현을위한 번역, 혼합 하였다. 우리는 말라리아 단백질을 표현하는 방법에 대해 설명합니다; 소수성 PF3D7_0114100 마우어의 갈라진 - 2 트랜스 (PfMC-2TM) 단백질, 친수성 ​​PF3D7_0925900 단백질 및 헬라 계 무 세포 발현 시스템을 이용하여 단백질을 함유 PF3D7_1361800 딜 반복. 단백질은 2 단계 및 1 단계 식 전략을 이용한 마이크로 부피로 표현된다. 친 화성 정제 방법이 또한 기재되어있는 시험 관내 인간 무 세포 발현 시스템을 이용하여 발현 된 단백질의 25 μL를 정화한다. 단백질의 수율은 브래드 포드 분석에 의해 결정되고 표현정제 된 단백질은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 표현 재조합 단백질은 면역, 면역 분석 및 단백질 서열 분석에 사용될 수있다.

특정 항체와의 반응성을 통해 발현 된 재조합 단백질의 유효성이 발현 된 단백질의 적당한 폴딩을 확인하는 중요한 첫 단계이다. 재조합 말라리아 단백질은 하나의 단계 및 시험 관내 인간 세포 무료 발현 시스템의 두 단계를 사용하여 표현 하였다. 재조합 단백질 정제 니켈 킬레이트 친 화성 방법입니다. 우리는 다음 SDS-PAGE 분리 된 재조합 단백질의 서쪽 블로 팅에서 전체 merozoite의 rhoptries에 대?...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다.

의 발현에 대한 헬라 세포를 기반으로 무료 발현 시스템<em&gt; 변형체</em&gt; Rhoptry 단백질

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K 조회수.  Cleveland State University.  셀 기반 시스템에서 말라리아 단백질의 발현은 도전 남아있다. 우리는 HeLa 세포에서 말라리아 재조합 rhoptry 단백질을 표현하는 두 단계 및 (체외 번역) 한 단계 IVT 세포 무료 발현 시스템을 보여줍니다. 우리 rhoptry 단백질을 정제하는 니켈 계 수지 친화 정제 시스템을 사용한다. 

비디오: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

구현을위한 프로토콜<em&gt; 대장균</em합성 생물학&gt;을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...