이 프로토콜은 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 뇌 오르가노이드를 사용하는 것을 목표로합니다. 그것은 그들의 미토콘드리아 속성의 평가에 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 개발되었다. 이 방법은 고가의 생물 반응기와 시간이 많이 소요되는 포함 절차를 필요로하지 않습니다.
따라서 구현하기 쉽고 고급스입니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하고 미토콘드리아 특성을 테스트 할 수 있게합니다. 이것은 치료할 수 없는 미토콘드리아 질병을 위한 내정간섭 표적의 확인으로 이끌어 낼 수 있습니다.
우선, 코팅된 6웰 플레이트의 iPSC 배지에서 피더가 없는 조건에서 인간 iPSC를 배양하고 가습화된 조직 배양 배양인인 배양기를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지한다. iPSC를 효소 없는 분리 배지를 사용하여 80%의 결합으로 통과하여 1대 4에서 12까지 의 비율로 측정합니다. 세포 생존을 증가시키기 위하여는, 각 분할 후에 10 개의 micromolar rho 관련 단백질 키나아제 또는 ROCK 억제제를 추가합니다.
0일차면 80%의 iPSC를 분리합니다. 피질 분화 매체 1 또는 CDM1을 준비하고 세포에 추가하기 전에 실온에서 미리 데워보도록 하십시오. 죽은 세포와 파편을 제거하기 위해 PBS와 iPSC를 포함하는 우물을 세척합니다.
500 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 시약 A를 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 현미경으로 확인하여 세포 분리를 보장하십시오. iPSC 배지 1밀리리터를 추가하여 시약 A를 희석하여 활동을 중화시합니다.
1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 세포를 위아래로 배관하여 세포를 해리하고 셀 서스펜션을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. iPSCs를 실온에서 5분 동안 125회 G로 부드럽게 원심분리한 다음, 셀 펠릿을 방해하지 않도록 슈퍼나탄을 조심스럽게 흡인시합니다. 단일 셀 현탁액을 얻고 세포 수를 계산하기 위해 CDM1의 1 밀리리터로 펠릿을 다시 중단합니다.
CDM1내 100마이크로리터당 9, 000iPSC, 마이크로몰러 WNT 카테닌 억제제 또는 IWR-1 3개, 마이크로몰러 SB-431542로 파종 배지를 준비한다. 잘 100 마이크로리터의 파종 매체를 96웰 V 하단 플레이트에 추가합니다. 플레이트를 가습 조직 배양 인큐베이터에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하십시오.
신경구를 생성하기 위하여는, 첫날에, 정의된 매끄러운 테두리를 가진 둥근 세포 응집체가 형성되고 있다는 것을 관찰합니다. 골재 주위의 죽은 세포를 기록합니다. 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 문화를 계속 합니다.
셋째 날에는 양면을 세 번 눌러 죽은 세포를 분리한 다음 20마이크로몰러 ROCK 억제제, 3개의 마이크로몰러 IWR-1, 5개의 마이크로몰러 SB-431542로 보충된 CDM1 의 마이크로리터 100개를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 보관하십시오. 6일째에는 각 우물에서 상피 배지의 80마이크로리터를 조심스럽게 제거합니다.
우물의 바닥을 만지지 마십시오. 3개의 마이크로몰러 IWR-1과 5개의 마이크로몰러 SB-431542로 보충된 CDM1의 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 배양합니다. 18일까지 3일마다 이전 단계를 반복합니다.
18일째에 신경구를 옮기고 CDM2를 준비하고 100mm 초저 부착 세포 배양판에 10 밀리리터를 추가합니다. 팁이 잘린 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 100mm 초저 부착 세포 배양 판으로 둥근 신경구를 전달합니다. 신경구를 포함하는 접시에서 5 밀리리터의 매체를 제거하고 신선한 CDM2의 5 밀리리터를 추가합니다.
가습조직 배양 배양기 내부에 분당 70회 회전하여 플레이트를 궤도 셰이커에 놓습니다. 3일마다 슈퍼내트 매체를 조심스럽게 흡인하고 신선한 CDM2로 교체하십시오. 소량의 배지를 남겨 신경구가 건조되는 것을 방지하십시오.
35일째, CDM3를 준비합니다. 접시에서 매체를 흡인하고 차가운 CDM3의 10 밀리리터를 추가합니다. 매체를 변경한 후, 가습조직 배양배 인큐베이터 내부에 분당 70회전에서 플레이트를 다시 궤도 셰이커에 다시 놓습니다.
매체의 색에 표시된 대로 성장 속도에 따라 3~5일마다 배지를 변경합니다. 70일째되면 CDM4를 준비합니다. 원하는 오르가노이드 에 도달할 때까지 CDM4 배지를 사용합니다.
이 기간 동안, 37섭씨 와 5%의 이산화탄소에서 가습조직 배양 배양내부의 분당 70회전으로 설정된 궤도 셰이커에 플레이트를 보관하십시오. 성장률에 따라 3~5일마다 배지를 변경합니다. 4% PFA 솔루션을 준비하고 안전 후드 아래에 놓습니다.
뇌 오르가노이드를 수집하고 부드럽게 PFA로 채워진 6 웰 플레이트에 무딘 팁 세 밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 전송합니다. 실온에서 1시간 동안 PFA 용액에 오르가노이드를 보관하십시오. 3밀리리터 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로 PFA를 조심스럽게 제거하고 PBS를 사용하여 고정 된 오르가노이드를 세 번 세척하십시오.
고정 된 오르가노이드를 PBS에 섭씨 4도에 저장하여 추가 사용까지 보관하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 오르가노이드에는 축선 및 담장에 특정한 단백질 마커를 사용하여 시각화할 수 있는 성숙한 뉴런이 포함되어 있습니다. 성숙한 오르가노이드는 신경 세포뿐만 아니라 신경 세포도 포함합니다.
슬라이스 된 뇌 오르가노이드 분석을 사용하여 SMI 312 양성 축록산 및 MAP2 양성 펜드라이트 또는 S100 베타 신경교 세포를 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 공초점 심은 베타-3 튜룰린 양성 뉴런에 대하여 SOX2 양성 신경 전구의 상세한 분포 및 조직을 조사하는 데 도움이 됩니다. 뇌 오르가노이드는 외부 막 또는 TOM20의 트랜스로케이스와 같은 미토콘드리아 특이적 마커를 위해 염색되었다.
뇌 오르가노이드의 생체 에너지 프로파일링은 산소 소비속도, 또는 OCR, 및 세포외 산성화 율 또는 ECAR를 이용한 글리코리스틱 대사를 모두 측정하여 수행되었다. OligomycinOCR 프로파일의 하락을 야기하므로 ATP 생산에 필요한 OCR을 식별합니다. 올리고마이신 치료에 따라, 또한 ECAR의 보상 증가가 있을 수 있습니다 세포가 신진 대사 스트레스를 방지하기 위해 혈당을 조절 할 수 있음을 시사.
96웰 플레이트에서 배양 판으로 신경구를 옮기거나 고정 시술 중에 유기체를 부드럽게 처리하여 손상을 입히지 않도록 하는 것이 중요합니다. 뇌 오르가노이드의 생성에 따라, 다중 전극 배열 또는 칼슘 이미징은 오르가노이드의 기능을 테스트하는 이상적인 방법이 될 것입니다.
