이 프로토콜은 견고성 및 신뢰성과 같은 오가노이드 생성에 존재하는 몇 가지 주요 문제를 해결하며, 우리는 이러한 개선 된 오가노이드를 신경 노화에 대한 혁신적인 연구에 적용 할 수있었습니다. 이질성과 재현성은 피질 뇌 오가노이드를 생성 할 때 중요한 문제입니다. 이를 극복하기 위해 우리는 먼저 hPSC를 신경 외배엽 콜로니로 분화 한 다음 재현 가능한 조직 구조를 생성하는 신경 상피 구상체로 구별합니다.
이러한 피질 뇌 오가노이드는 장기간의 시험관 내 배양 후 노화의 전형적인 징후를 나타내기 시작하여 노화와 관련된 신경 과정을 연구하는 데 유용한 플랫폼이됩니다. 시작하기 위해, hPSC 콜로니를 60% 컨플루언시에서 6개의 웰 플레이트 중 하나의 웰로부터 hESC 적격 기저막 매트릭스 상에 플레이트화하여 20 내지 30% 밀도를 달성한 다음, 2D 신경외배엽 콜로니의 유도를 진행한다. 다음 사흘 동안 매일 이중 SMAD 억제제가 보충된 신선한 N2 배지를 각 웰에 첨가하십시오.
유도된 2D 신경외배엽 콜로니로부터 3D 신경외배엽 구상체를 생성하려면, 여섯 웰 플레이트에서 2밀리리터의 N2 배지를 제거하고 HBSS로 한 번 세척하여 모든 N2 배지가 제거되도록 한다. 잘 들어있는 각 식민지에 한 밀리리터의 디스 파제를 첨가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 20 ~ 25 분 동안 배양하고 콜로니 분리를 정기적으로 확인하십시오.
인큐베이션이 끝날 때, 디스파제 효소의 활성을 중지시키기 위해, 웰에 N2 배지 1밀리리터를 첨가한다. 넓은 보어 P1000 피펫 팁 또는 멸균 가위로 절단된 수정된 P1000 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 15밀리리터 튜브로 옮기고 콜로니 덩어리가 중력으로 튜브 바닥으로 가라앉을 수 있도록 합니다. 그런 다음 표준 P1000 피펫 팁으로 조심스럽게 상층액을 제거하십시오.
신선한 N2 배지 1 밀리리터로 교체하고 세 번 세척을 반복하여 dispase를 완전히 제거하십시오. 세포 덩어리 및 N2 배지를 재현탁시킨 후, 세포 현탁액을 여섯 웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 밀리리터 당 40 나노그램의 bFGF를 첨가한다. 오가노이드를 동결절제한 후, 슬라이드를 뚜껑이 있는 슬라이드 염색 용기에 옮겨 과량의 장착 용액을 제거하고, 절편된 유기조직 조직을 실온에서 10분 동안 PBS로 세 번 세척한다.
그런 다음 슬라이드를 섭씨 37도에서 밤새 갓 만든 베타-갈락토시다제 염색 용액으로 인큐베이션한다. 염색된 조직을 PBS로 세 번 세척하여 상온에서 각각 10분 동안 베타갈락토시다제 용액을 제거하였다. 이제 세척 된 조직을 유리 페이드 방지 장착제로 장착하고 현미경으로 보기 전에 장착 용액이 실온에서 30 분 동안 응고되도록하십시오.
신경외배엽 분화 전에, hPSC 콜로니는 분화된 세포가 콜로니를 오염시키지 않으면서 타이트한 편평한 단층 형태를 나타내었다. NANOG의 발현은 또한 hPSC 콜로니의 다능성을 확인하였다. hPSC 콜로니를 신경외배엽 콜로니로 분화시킨 후, 더 긴 기둥형 형태가 관찰되었고, 이들은 NANOG에 대해 음성이었다.
N2에서 FGF2에 대한 디스파아제 처리 및 노출 후, 이들 구상체 내의 신경 줄기 세포는 증식하고 스페로이드의 중심 및 외부 가장자리에 있는 세포에서 Z01의 발현에 의해 스페로이드의 정점-기저 극성을 입증하는 상당한 수의 신경 로제트를 형성하였다. 일단 매립되면, 스페로이드는 빠르게 증식하고 싹트기 시작하며, 조밀 한 조직 노드의 존재와 일주일에서 삼 주 사이에 본체로부터 바깥쪽으로 확장됨으로써 나타나며, 이는 정량 분석에 의해 추가로 확인되었고 스페로이드 직경은 삼 주에 걸쳐 유의하게 증가하였다. 면역형광 염색은 명확한 층상으로 오가노이드 내의 신경 전구 세포 및 피질층 마커의 존재를 확인하였고, 이는 상이한 시점들에 걸쳐 관찰가능하였다.
뇌에 대한 신경 노화 관련 과정의 영향도 연구되었다. 시간이 지남에 따라, 노화와 관련된 베타-갈락토시다제의 존재의 현저한 증가가 관찰되었고, 13주째에, 노화를 나타내는 p21의 존재가 검출되었다. 과도한 디스파아제가 모두 제거되고 손상되지 않은 신경 외배엽 콜로니를 부드럽게 분리하고 다시 시드하여 건강한 구상체를 형성하는 것이 중요합니다.
인간의 뇌 노화의 생물학을 연구 할 수있는 독특한 기회의이 플랫폼은 또한 중요한 뇌 발달에 대한 연구를 가능하게합니다.이 오가노이드가 생물 반응기를 사용하여 배양되는 경우.
