이 절차의 전반적인 목표는 동물 모델에서 파킨슨 병의 필수 측면의 대부분을 재현하는 것입니다. 아데노-관련 바이러스 벡터의 입체택시 전달은, 흑질에서 인간 시누클레인을 코딩한다. 파킨슨 병은 도파민성 뉴런의 죽음, nigrostriatal 경로, 그리고 결과적으로 자발적인 운동의 통제력 상실의 진행을 포함하는 신경 퇴행성 장애입니다.
이 신경 퇴행성 과정은 주로 시누클레인에 의해 구성되는 뇌에 단백질 응집체의 침착에 의해 수반됩니다. 새로운 증거에 따르면, 시누클레인 응집체는 미세 아교세포의 톨 유사 수용체를 자극하여 흑질의 신경 염증을 유발할 수 있습니다. 더욱이, 증거는 시누클레인 응집체가 항원 제시 세포에 의해 T 세포에 포획되고 제시될 수 있고, 시누클레인에 특이적인 적응 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타낸다.
흑질에서 인간 시누클레인을 코딩하는 아데노-관련 바이러스 벡터의 입체택시 전달은, 시누클레인 병리, 미세아교세포 활성화, T 세포 활성화, 신경변성 및 운동 장애를 포함하는 질환의 많은 필수적인 측면을 재현하는 것으로 나타났다. 이 연구는 바이러스 벡터와 바이러스 벡터 전달 후 시간이 어떻게 인간 시누클레인 발현, 신경 변성 및 nigrostriatal 경로에서의 신경 염증에 미치는 정도뿐만 아니라 흑질에서 인간 시누클레인의 일방적 입체 택시 전달의 마우스 모델에서의 운동 장애 정도에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 분석을 제시합니다. 무균 환경을 유지하려면 신발 커버, 수술 마스크, 위생 장벽, 장갑 및 수술 캡을 포함하여 전체 수술 중에 적절한 수술복을 착용하십시오.
무균 환경을 유지하기 위해 마우스와 모든 수술 재료에 에탄올을 뿌리십시오. 진통제를 유도하려면 12 시간마다 카프로펜을 피하 주사하고 수술 1 시간 전에 시작하여 수술 후 사흘까지 계속하십시오. 마우스를 마취하려면 동물을 유도 챔버에 넣으십시오.
이소플루란 흐름을 0.5 %의 속도로 연 다음 마우스가 오른쪽 반사를 잃을 때까지 약 5 분 동안 천천히 5 %까지 증가시킵니다. 유도 챔버에서 동물을 제거한다. 즉시 동물을 적절한 크기의 코 콘이있는 비 호흡 회로로 옮깁니다.
수술 전 시간 동안 이소플루란으로 마우스 마취를 1 % 유지하십시오. 마우스가 꼬리와 발을 꼬집어 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 꼬리와 발을 꼬집을 때 마우스가 반응하지 않으면 마우스가 완전히 마취되었음을 의미합니다.
가위를 사용하여 마우스 머리를 면도하십시오. 클로르헥시딘 2 %의 면봉을 사용하여 마우스 피부를 닦고 모든 머리카락을 제거하십시오. 마우스 헤드를 스테레오택시 프레임에 고정합니다.
면봉을 사용하여 양쪽 마우스 눈에 각막 보호제를 놓습니다. 다른 설치류의 스트레스 유도를 방지하려면 수술실에 다른 마우스가 있으면 피하십시오. 클로르헥시딘 2 %의 세 라운드로 마우스 머리를 닦은 다음 에탄올 70 % 외과 용 재료를 사용하여 두개골을 노출하고 내측선에 대해 좌표 전후 2.8mm, 평측 1.4mm에서 드릴로 얇은 구멍을 뚫습니다.
구멍에 10 마이크로 리터 주사기의 바늘을 넣고, dura에 대하여 7.2 mm 등복부에 도달 할 때까지 바늘을 천천히 뇌 안쪽으로 옮깁니다. 바늘을 2 분 동안 최종 위치에 두어 조직이 약간 침전 될 수 있도록 한 다음 30 초마다 0.2 마이크로 리터의 속도로 오른쪽 흑질에 한 마이크로 리터의 바이러스 벡터를 주입하십시오. 바이러스 벡터의 전달 후 다섯 분 동안 바늘을 같은 위치에 둔 다음 천천히 철회하십시오.
멸균 실크 봉합사를 사용하여 상처를 닫습니다. 마우스를 가정용 케이지에 넣고 전기 따뜻한 매트리스 위에 올려 놓아 미리 따뜻하게하십시오. 입체 택시 수술 후 12 주 후, 이전에 설명 된 빔 테스트의 단순화 된 버전을 사용하여 모터 성능을 평가하십시오.
이를 위해 길이 25cm, 너비 3cm의 수평 빔을 사용하십시오. 빔 표면은 한 센티미터의 사각형이있는 금속 격자로 덮여 있어야하며 빔 위로 한 센티미터 상승해야합니다. 그리드 표면 빔을 횡단하면서 홈 케이지가 있는 빔의 한쪽 끝에서 반대쪽 끝으로 마우스의 비디오를 만듭니다.
모터 성능을 결정하기 전에 이틀 동안 마우스를 훈련시킵니다. 첫날에는 그리드없이 빔을 다섯 번 통과하도록 마우스를 훈련시킵니다. 둘째 날에는 그리드가있는 상태에서 빔을 다섯 번 걷도록 마우스를 훈련시킵니다.
셋째 날에 모터 성능을 평가하십시오. 이렇게하려면 슬로우 모션 모드에서 비디오를 보면서 왼쪽 발 또는 오른쪽 발에 의해 수행 된 오류 수를 정량화하십시오. 마우스를 마취하려면 케타민과 자일라진의 혼합물을 복강 내로 주입하십시오.
마우스가 완전히 마취되면 수술 재료로 흉부를 열고 심장을 노출시킵니다. 그런 다음 평평한 팁 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하십시오. 바늘을 파이프에 결합시켜 연동 펌프를 사용하여 분당 9.5 밀리리터의 속도로 50 밀리리터의 인산염 완충 식염수를 관류합니다.
가위와 핀셋을 사용하여 뇌를 제거한 다음 인산염 완충 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 다섯 밀리리터에 담그면 고정됩니다. 그 후, 고정 된 뇌를 15 밀리리터의 30 % sucrose에 48 시간 동안 넣으십시오. 그런 다음 뇌를 네 밀리리터의 냉동 보호 용액에 넣고 뇌를 80도에서 저장하거나 다음 단계에서 즉시 사용하십시오.
줄무늬 조각을 얻으려면 뇌를 40 마이크로 미터 두께의 섹션으로 자르고 1.34mm에서 시작하여 0.26mm에서 마무리하십시오. 전후 순서에 따라 두 밀리리터의 냉동 튜브로 각 조각을 수확하십시오. 선조체에서 면역 조직 화학 및 면역 형광 분석을 수행하려면 균일 한 간격으로 취해진 다섯 개의 코로나 삼중항 절편을 선택하여 핵의 전체 rostrocaudal 정도를 덮습니다.
nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 바이러스 벡터의 정확한 전달을 검증하기 위해, GFP를 코딩하는 벡터를 흑질에 주입하고, 흑질에 주입하고, 12주 후, GFP 형광 및 티로신 하이드록실라제 면역반응성을 면역형광에 의해 흑질과 선조체에서 분석하였다. GFP 관련 형광은, 동측성 부위에만 독점적으로 위치하였고, 티로신 하이드록실라제 면역반응성과의 유의한 공동국소화가 흑질과 선조체 둘 다에서 관찰되었으며, 이는 nigrostriatal 경로의 도파민성 뉴런에서 바이러스 벡터의 정확한 전달을 나타낸다. 필요한 시누클레인을 코딩하는 벡터의 투여량을 시험하기 위해, 니그랄 도파민성 뉴런의 신경변성을 촉진하는 인간 시누클레인의 유의한 과발현을 유도하기 위해, 벡터의 상이한 투여량을 주입하였다.
그리고 12주 후, 인간 시누클레인 면역반응성, 및 티로신 하이드록실라제 면역반응성의 정도를 니그로스트리아 경로에서 시험하였다. 인간 시누클레인 면역반응성은 명백하였고, 모든 투여량은 흑질에서 시험되었다. 그러나, 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈을 수용한 마우스만이 선조체에서 명백한 인간 시누클레인 면역반응성을 제시하였다.
마우스 당 10개의 바이러스 게놈을 수용한 마우스는 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터의 마우스로, 흑질에서 도파민성 뉴런의 상당한 손실을 나타내었다. GFP를 코딩하는 벡터의 동일한 용량을 받은 마우스는 낮은 정도의 뉴런 손실을 나타냈지만, 이들 마우스는 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터를 투여받은 마우스와 비교하여 상당히 낮은 신경변성 정도를 보였다. 빔 테스트를 사용하여, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터의 마우스 당 10 내지 10 개의 바이러스 게놈을 수신하거나, 오른쪽 및 왼쪽 발에 의해 만들어진 오류 수를 비교할 때, 또는 총 오류 수를 비교할 때, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터를 수신하는 마우스의 총 오류 수를 비교할 때, 그 마우스에서 독점적으로 운동 성능의 현저한 감소가 검출되었다. 대조군 벡터를 받은 마우스와 함께.
인간 시누클레인 발현의 발병을 정의하기 위해, 마우스는 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈, 인간 시누클레인을 코딩하는 벡터, 또는 가짜 수술로 치료되었고, 인간 시누클레인 발현의 정도를 입체택시 수술 후 일주일에 한 번, 두 주 내지 다섯 주 동안 흑질에서 분석하였다. 결과는 인간 시누클레인 발현이 입체 택시 수술 후 다섯 번째 주에 분명해지기 시작했다는 것을 보여준다. 미세아교세포 활성화의 피크를 결정하기 위해, 높은 수준의 Iba1을 발현하는 세포의 정도를, 수술 후 2-15주 동안 마우스의 선조체에서 정량화하였다.
상기 결과는 바이러스 접종 후 15주 후인 마우스의 대측성 측면과 비교하여 동측성 측의 미세아교세포 활성화의 현저한 증가를 보여준다. 실질적인 니그라 내로 침윤된 조절 T 세포의 수를 상이한 시점에서 분석하였고, 면역형광에 의한 입체택시 수술 후, 공초점 현미경 관찰에 이어진다. 흑질로의 조절 T 세포 침윤의 피크는 수술 후 11주째에 관찰되었다.
여기에서 분석된 신경변성의 마우스 모델은, 파킨슨병의 병태생리학에 관여하는 주요 양태의 다수를 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 시누클레인 병리, 미세아교세포 활성화, 말초 면역계의 관여, 신경염증, 및 신경변성의 기작에 관여하는 관여 기작 신경변성, 신경염증, T-세포 침윤 및 운동 장애를 유도하는 아데노-관련 바이러스 벡터, 인간 시누클레인을 코딩하는 아형 다섯형의 적절한 투여량은 마우스 당 10 내지 10개의 바이러스 게놈이다. 이 연구는 입체 택시 수술 후 다섯 주가 인간 시누클레인 발현이 이미 분명하지만이 동물 모델에서 운동 장애가없는 핵심 시점을 구성한다는 것을 보여줍니다.
이에 의해, 이 시점은, 흥미로운 시간적 시점을 나타내고, 신경염증 및 신경변성의 진행을 중단시키기 위해 맞춤화된 실험적 치료법의 투여를 시작한다. 이 동물 모델에서 신경 염증을 분석하기에 가장 적합한 시점은 입체 조영 수술 후 15 주째입니다. 중추신경계로의 T-세포 침윤을 분석하기에 적절한 시점이 되는 동안.
바이러스 벡터 접종 후 11 주째에있는 것으로 보입니다.
