이 프로토콜을 통해 우리는 생체 내 특성을 밀접하게 모방하는 조건에서 미세아교세포를 배양할 수 있습니다. 자성 세포 분류 기술을 사용하는 당사의 프로토콜을 사용하면 배양 배지에서 혈청을 사용하지 않고 시험관 내에서 이틀만 미세아교세포를 자극할 수 있습니다. 시작하려면 작은 가위를 사용하여 15-20 밀리미터의 시상 봉합사 후 목에서 코까지 피부를 자릅니다.
구멍 매그넘이 두개골과 평행하도록 팁을 삽입하십시오. 양쪽에서 눈으로 자릅니다. 작은 가위로 눈 사이를 잘라 머리에서 두개골과 뇌를 분리하십시오.
두 개의 집게로 후각 구근에 가까운 두개골을 잡고 조심스럽게 두개골을 찢습니다. 면도날로 소뇌와 후각 전구를 제거하고 뇌를 두 조각으로 자릅니다. 칼슘과 마그네슘이없는 40 밀리리터의 HBSS가 들어있는 페트리 접시에 뇌 조각을 넣으십시오.
이 표에 따라 해리 혼합물을 준비하십시오. 12개의 뇌 조각을 C 튜브로 옮기면 해리 튜브당 총 무게가 1.2g입니다. 그런 다음 가열로 디스 소시아 이터에 C 튜브를 놓습니다.
디소시아터에서 최적화된 NTDK 프로그램을 시작합니다. 20 초 동안 원심 분리기. 피펫팅을 세 번 하여 기계적 해리를 완료합니다.
스트레이너가 부착 된 4 개의 15 밀리리터 튜브로 세포를 옮깁니다. 칼슘과 마그네슘이 함유 된 HBSS 10ml로 여과기를 헹굽니다. 10분 동안 원심분리하고, 10밀리리터 피펫으로 상층액을 제거한다.
칼슘과 마그네슘이 함유 된 HBSS 10 밀리리터를 조심스럽게 첨가하고 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다시, 원심분리하여 상청액을 제거한다. 6 밀리리터의 분류 버퍼로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
원심분리를 반복하고 상청액을 버린다. 그런 다음 200 마이크로리터의 CD11b 마이크로비드 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 15 내지 20분 동안 튜브를 배양한다. 배양 후, 6 밀리리터의 분류 완충액으로 펠렛을 다시 현탁시킨다.
원심분리를 반복하고 8밀리리터의 분류 완충액으로 펠릿을 다시 현탁시킨다. 다음으로 구분 기호의 Possel 프로그램에 따라 8 개의 열을 준비합니다. 한 번에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 추가하여 컬럼을 통해 세포를 통과시킵니다.
1밀리리터의 분류 완충액을 사용하여 멸균 용리 플레이트에서 CD11b 양성 세포를 용리합니다. 세포를 50 밀리리터 튜브에 모으십시오. 원심분리하고 10ml의 차가운 미세아교세포 배지로 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
CD11b 양성 세포를 세십시오. 밀리리터 당 650, 000 내지 700, 000 세포의 최종 농도를 얻기 위해 차가운 미세아교세포 배지에 세포를 재현탁시킨다. 세포 배양 플레이트에 현탁액을 분주한다.
플레이트를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다. 다음날, 배지를 예열 된 미세 아교 세포 배지로 교체하고 밤새 배양을 반복하십시오. 이 단계 전에 세포를 자극하고, 자극의 마지막 3시간 동안 식세포 분석을 수행한다.
이 표에 따라 셀당 50개의 비드 비율로 비드 수를 계산합니다. 비드 혼합물을 준비하십시오. 섭씨 37 도의 수조에서 1 시간 동안 튜브를 배양하십시오.
10 분마다 소용돌이. 각 웰에, 계산된 부피의 비드 용액을 첨가하고 3시간 동안 배양한다. 이 접근법을 사용하여, 마이크로 아교 세포의 식세포 활성은 인터루킨 -1 베타, 인터페론 감마 또는 지질 다당류와 같은 전 염증 인자에 의한 자극 후 평가되었다.
6 내지 24시간 동안 자극한 후, 형광 Cy3 미세아교세포 비드를 공초점 현미경으로 분석하였다. 6시간 후, 미세아교세포는 인터루킨-1 베타와 인터페론 감마 조건에서만 Cy3 비드를 식세포화하기 시작합니다. 24 시간 후, 두 종류의 자극에 대해 Cy3 형광이 증가하여 증가 된 식세포 활성을 강조했습니다.
미세아교세포 배양의 순도는 유세포분석에 의해 상승되었으며, 이는 분류 후 세포 생존율의 증가를 보였다. 유세포분석기 및 RT-qPCR 세포 집단 마커를 사용하여 출생 후 8일째에 마우스 뇌로부터 CD11b-양성 세포를 분류하기 전후에 분석하였다. 이러한 분석은 미세아교세포에 대한 CX3CR135, 희소돌기아교세포에 대한 O4 또는 OLIG2, 뉴런에 대한 NeuN 또는 시냅토피신, 성상교세포에 대한 ACSA-2 또는 GFAP와 같은 다양한 뇌 세포 집단을 구별했습니다.
CD11b 항체를 이용한 세포 분류 후, 미세아교세포만을 수득하였다. 막힘을 방지하고 기계적 세포 사멸을 방지하기 위해 컬럼에 현탁액을 추가하는 동안 매우 부드럽게 피펫팅하는 것이 중요합니다. 이 방법 후에, 서양 혈액 또는 Luminex와 같은 전사체 단백질체학, 심지어 면역 화학이 미세 아교 세포 자극의 효과를보기 위해 수행 될 수있다.
