Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

다음 프로토콜은 뉴 잉글랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 다음 프로토콜은 4 성인 마우스 척수에서 아교 문화를 준비입니다. 무균 조건 하에서 문화 후드에서 솔루션 1. 준비 <ol><li> 배양 배지를 준비 : 이글 미디어 (cDMEM) DMEM을 함유하는 완전한 둘 베코 변형 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 IU / ㎖ 페니실린 (4.5 g / L의 포도당), 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 250 NG / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 50 μM 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME는, 1.1.1 참조). 믹스와 다른 모든 구성 요소를 소독 필터링하고 FBS를 추가합니다. 4 오 ℃에서 배양 배지를 저장 <ol><li> 50 ㎜ × 2-ME / 인산 완충 식염수 (PBS) 스톡 용액을 제조 하였다 : 100 ㎕를 추가 농축 2 ME 28.6 1X PBS mL를 필터 소독 (용액을 4 ℃로 저장 될 수로 (14.3 M) 몇 달). 유문화 미디어의 1,000 mL의 2-ME 원액의 자체 1 mL를. </li></ol></li><li> 밀도 구배 매체의 제조 <ol><li> 주식 등장 밀도 구배 매체 용액을 제조 하였다 (예를 들어, 100 % 퍼콜) 1 부 배 정규 멸균 PBS 9 부 멸균 스톡 밀도 구배 매체 (예를 들어, 퍼콜) 발. </li><li> 20 %의 밀도 구배 매체 (예를 들면, 1X PBS 40 mL로 100 % 밀도 구배 배지 10 mL)을 만들기 위해 정기적 1X 멸균 PBS로 (1.2.1 제) 100 % 밀도 구배 매체를 희석 4에서 보관 오 C. 세포 배양을 준비하기 전에, 실온 (RT) 내지 20 % 밀도 구배 매체를 준비한다. </li></ol></li><li> 파파인 해리 시스템에서 용액의 제조 주 : 파파인 해리 시스템은 자료 표에서 확인할 수있다. (자체 조립 포함) 다른 유사한 분리 키트를 사용할 수도있다. 모든 compone국세청은 멸균해야합니다. <ol><li> ovomucoid 억제제 혼합물 (분말)에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 32 ML을 추가합니다. </li><li> 하나 파파인 바이알 (분말)에 EBSS 5 mL를 추가합니다. 10 분 동안 또는 파파인이 용해 될 때까지 37 O를 C의 물을 욕조에있는 파파인 병을 놓습니다. </li><li> 한 DNase의 바이알 (분말)에 EBSS 500 μL를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 파파인 유리 병에 DNase의 솔루션 (위) 250 μL를 추가합니다. </li><li> 필요한 상기 파파인 / DNase의 혼합물 (마우스 척수 당 파파인 / DNase의 혼합물을 약 800 μL)의 총량을 계산 및 조직 분해 (단계 3.2)에 대한 50 ㎖ 튜브에 필요한 혼합물을 옮긴다. 적어도 2 주 동안 4 ° C에서 원래 유리 병에 남은 저장합니다. </li><li> 필요할 때까지 얼음에 키트의 모든 구성 요소를 유지합니다. </li></ol></li><li> 척수 수집 튜브를 준비 하나 멸균 15ml의 튜브를 5 ㎖ 행크 균형 염 용액 (HBSS로의 상기 파파인 해리 시스템에서,0; 1X PBS와 척수)와 하나의 멸균 15 ML의 튜브를 수집 (5 ML의 주사기를 채우는) 단계 2.4를 참조하십시오. 또한, HBSS의 5 mL로 한 멸균 페트리 접시 (35mm 또는 60mm)를 준비하고 문화 후드에 보관합니다. </li></ol> 2. 척수 컬렉션 주 : 모든 장비는 멸균해야합니다. IACUC 승인 지정된 지역에서 컬렉션을 수행합니다. <ol><li> 수확 마우스 척수에 대한 다음과 같은 도구를 얻 바로 날카로운 / 무딘 18 cm 수술 가위, 12 cm 표준 메스 (# 3 고체), 탄소 강철 멸균 메스 블레이드 # 10, 작은 동물 decapitator, 12 cm 표준 곡선 겸자 및 멸균 20G 바늘 5 ml 주사기에 부착. </li><li> CO 2 동물을 안락사 마우스 헤드와 70 % 에탄올 (EtOH 중)과 후방 영역 소독. </li><li> decapitator과 동물의 목을 벨. 근육 층을 노출시키는 하부 후면 중간 세로 절개를. 하다엉덩이 수준에서 척추 칼럼을 통해 깨끗한 절개는 멸균 바로 수술 가위 (18cm)와 (또한 척추 열을 덮고있는 근육 층을 통해 절단). </li><li> 일회용 신선한 닦아 장에 동물을 배치합니다. 조심스럽게 주동이쪽으로 척추에 (멸균 1X PBS (단계 1.4)로 가득 찬 5 ML의 주사기에 부착) 20 G 바늘을 삽입합니다. 아래로 단단히 동물을 잡고 신속하게 주사기를 밀어 넣습니다. 전체 척수는 자궁 끝에서 나올 것이다. HBSS를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 척수 수집. </li><li> 마우스의 나머지 단계를 반복 2.4. 각 동물 사이에, 70 % EtOH로 모든 중고 악기를 소독. 주 : 일반적으로, 12- 웰 플레이트는 매 4 마우스 척수 (4.3 참조)에 대해 설정 될 수있다. </li></ol> 단일 세포 현탁액 3. 준비 참고 : 무균 모든 것을 유지하기 위해 문화 후드의 단계 3과 4를 수행합니다. <ol><li> HBSS 함유 배양 접시 (단계 1.4)에 모든 척추 코드를 전송합니다. 멸균 가위와 집게로 많은 훌륭한, 작은 조각으로 척수의 각을 잘라. 이것이 상기 제조 된 희석 된 바와 같이 무균 핀셋 또는 10 ㎖ 피펫을 사용하여 제조 된 파파인 / DNase의 효소 혼합물 (단계 1.3.5)를 함유하는 50 mL의 원뿔 관 척수 조직을 트랜스퍼 (효소 혼합물로 HBSS를 추가하지 효소 용액과 효소의 성능이 저하 될 수 있습니다). </li><li> 섞어 부드럽게 튜브를 소용돌이. 궤도는 150 rpm으로 진탕 배양기 / 쉐이커에 1 시간 동안 37 ℃로 튜브를 품어. </li><li> 와류 튜브 다시 격렬 상기 해리를 촉진하기 위해 5 ㎖ 피펫을 사용하여 조직과 효소 용액을 씹다. </li><li> RT에서 5 분 동안 300 XG에 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 원심 분리 동안, 재구성 알부민 ovomucoid INH 300 μL와 2.7 mL의 EBSS를 혼합멸균 튜브에 ibitor 용액 (1.3.1). DNase의 용액 (단계 1.3.3)의 150 μL를 추가합니다. </li><li> 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 (단계 3.5) 상기 제조 한 용액과 세포 펠렛을 재현 탁. 소용돌이 잘 세포 펠렛을 깰 수 있습니다. </li><li> 세포 현탁액에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (단계 1.4.1)의 3 ML을 추가합니다. 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기 세포. (막 조각을 포함) 상층 액을 제거합니다. </li></ol> 단일 세포 현탁액에서 미엘린 4. 또한 제거 <ol><li> 제동없이 RT에서 30 분 동안 800 XG에서 세포 펠렛을 방해 부드럽게 세포 펠렛을 함유하는 튜브에 와동 (단계 1.2.2에서 제조) 20 % 밀도 구배 매체 8 mL를 넣어 원심 분리. 조심스럽게 이물질 (주로 수초)과 상층 액의 상단 층을 제거하지만, 펠렛을 유지한다. </li><li> resuspendi로 세포를 씻어, 밀도 구배의 잔해를 제거하려면희석 된 cDMEM 8 ㎖ (1 부 cDMEM 2 부분 HBSS)으로 세포 펠렛 겨. 4 O ℃에서 10 분 동안 400 XG에 세포를 원심 분리기 상등액을 제거하고 동일한 방식으로 희석 된 cDMEM (위)로 다시 세포를 세척 하였다. 를 파종 할 때까지 얼음 세포를 유지합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (cDMEM이와 함께 제공되는 2-ME (단계 1.1에서 준비)). 한 12 웰 플레이트를 들어, 3 ㎖ × 4 (사용하는 마우스의 수) + 2 mL의 = 14 mL의 미디어를 사용합니다. 이것은 전체 판에 충분한 세포 현탁액 (12 웰)가 확인되며, 웰 당 평균 셀 수와 배양 소교 콘텐츠를 결정하는데 이용 될 수있는 추가 우물을 제공한다. 배양 용기의 다른 형태가 사용되는 경우, 비례 적으로 필요한 배양 배지의 총 체적을 계산한다. </li><li> 12 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 % CO 2 35.9 ℃로 세포를 품어. </li><l4 D 후 (: 1, 4, 8, 11, 다음 날 12 일에 세포를 사용하여 일반적으로 D에 미디어를 변경) - 난&gt; D 1에 용지를 (흡입을 통해 이전 용지를 제거) 변경 후 매 3입니다. 주 : 1 일째에 배양 의한 척수 조직으로부터 잔류 미엘린에 파편 상당량 함유 할 수있다; 따라서, 1 일에 미디어를 변경 (자세한 내용은 토론 참조)을 권장합니다. D (12)에 잘 당 약 10 만 세포를 12 웰 플레이트에가, 14 셀 일반적으로 D 12에서 80 % 합류하고 일반적으로 D (14)에 의해 100 % 합류 근처가 될 수 - 문화 (12)은 D 사이의 치료를위한 준비 . </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> 그림 2 :. 혼합 아교 세포 문화의 설립 후 다른 시간에 혼합 된 아교 세포의 대표 이미지를 기본 척수 혼합 된 아교 세포는 성인 C57BL / 6 마우스에서 제조 하였다. 대표 이미지도금 후 아교 문화의 진행 상황을 보여줍니다. 1 일에, 일부 세포는 배양 접시에 부착하지만, 대부분은 여전히 ​​둥근된다. 부동 세포와 중요한 파편 많은도 있습니다. 4 일에, 세포의 대부분은 배양 플레이트에 부착된다. 세포는 눈에 보이는 프로세스와 분지 나타납니다. 세포는 산발적으로 분포되어 문화는 현재 약 20 ~ 30 %의 합류이다. 일 8시, 문화 50-60 %의 합류 사이. 문화의 일부 영역은 세포의 큰 패치가 있습니다. 문화의 다른 영역은 세포의 스파 스 성장을해야합니다. 패치 내에서 일부 세포는 &quot;광장 같은&quot;모습에 걸릴. 12 일째에, 배양 물 (여기에 도시 된 이미지에서, 약 90 %의 융합 성) 또는 80 % 이상 융합 성이다. 셀이 시점에서 성장의 로그 단계에와 12-14 실험의 신경교 세포를 사용하기위한 최적의 시간이다 일 사이입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <ol start="7"><li> 안티 마우스 CD45 및 안티 마우스 CD11b를 단일 클론 항체의 조합을 사용하여 표준 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 염색 프로토콜 (11)를 통해 별도의 우물에서 세포를 (4.3 단계)를 사용하여 미세 아교 내용을 검사합니다. CD45 + CD11b를 + 세포는 미세 아교 세포로 식별됩니다. </li></ol>

<ol>
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T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. 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H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

는 모든 단계를 포함한 실험 간 재현성있는 결과를 얻기 위해 일관된 방식으로 일정 변화 매체를 수행하는 것이 중요하다. 다음 단계는 우수한 품질의 성인 혼합 된 아교 세포를 얻기에 특히 중요하다. 효소 소화는이 프로토콜의 중요한 측면이다. 이 조직 조각을 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서 잘 소화하는 것이 중요하다. 그러나, 오버 소화 상당히 적은 세포에서 발생합니...

만성 통증은 최대 $ (635) 10 억의 추정 연간 비용으로, 미국에서 약 1 억 성인에 영향을 미치는 심각한 건강 문제이다. 증거 확보는 신경 병증 통증, 만성 통증이 가장 파괴 한 가지의 개발 척수 신경교 세포의 상당한 기여를 표시하고있다. 적절한 시험 관내 배양 시스템은 세포 및 분자 수준에서 신경교 세포의 역할을 조사 크게 도움이 될 것이다. 현재 연구에서 사용되는 시험 관내 신경교 배양 시스템은 신생아 마우스 또는 쥐의 뇌 피질 조직 유래 주로 아교 세포를 포함하는 불멸화 및 신생아 마우스로부터 유도 된 아교 세포주 또는 일차 신경교 세포를 쥐. 신생아 세포 따라서를 제공, 추가 (주로 성상 세포 및 미세 아교 세포) 신경 교세포로 분화 할 수있는 미분화 세포의 큰 숫자를 포함실험 사용 3 bundant 세포. 그러나, 우리의 이전 연구는 신생아의 뇌 신경 교세포는 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극에 성인 척수 아교 세포에서 크게 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 예를 들면, 인터루킨 (IL)는 -4 신생아의 뇌 신경교 4 비교 성숙한 래트 척수에서 신경교 (NO)의 생산 LPS 유도 된 산화 질소에 대한 억제 효과를 강화 표시됩니다. 또한, 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) 칼시토닌 신경 펩티드에 의한 자극에 따라 케모카인 생산의 프로파일은, (5. 참고 문헌에 기술 된 방법) 신생 마우스의 뇌 신경교 사이 말할 나위 다른 성인 마우스 척수 신경교 (도 1). 확립 된 세포주를 사용 및 유지 관리가 용이하고 단시간에 다수의 셀을 제공 할 수있다. 일반적으로, 세포주를 생성하거나 6, 7, 또는 다음의 제 (예 널리 사용 소교 세포주 BV2 등) 바이러스 - 매개 불멸화 시스템을 사용하는 불멸화자발 변환의 전자 식별 (예 성상 세포주 C8-D1A 및 소교 세포주 C8-B4)를 8, 9 세포주 개별적 성상 세포 및 미세 아교 세포의 분자 적 특징을 연구하는데 우수하다.; 그러나, 세포주에서 얻어진 결과는 항상 주요 세포 또는 생체 내 조건에서의 추가 확인을 요구한다. 또한 설치류의 척수 아교에서 유래하는 아교 세포주 보고서가 없었던 것을 주목해야한다. 신경 병증 성 통증, 성인 쥐 혼합 신경교 배양 (4)를 생성하는 데 사용되는 이전에보고 된 방법을 적용하여 개발 된 성인 마우스 척수로부터 유래 배양 시스템 (5)의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하는 데 도움 . 마우스 척수 폐해 문화는 더 최근에 (10)를 정제하고,이 문서에 자세히 설명되어 있습니다. 성인 척수 혼합 폐해 문화의 C는 특정 연구의 요구에 맞게 선택된 균주로부터 마우스를 확립하고, 세포를 배양 개시 게시 d는 최대 21 명까지 배양 유지할 수있다. 이 방법뿐만 아니라 -associated 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감각 신경 병증, 복수 등의 척수 내 병리학 적 변화를 포함하는 다양한 신경 질환의 연구에서, 신경병 통증의 연구에 사용될 수있다 경화증 (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

척수 신경교 반응은 신경 병증 통증의 발전에 크게 기여하는 것이 잘 인정되었다. 세포 및 분자 수준에서 신경교 활동에 대한 상당한 정보를 시험 관내 세포 배양 시스템을 통해 얻어진다. 사용 된 시험 관내 시스템은 주로 신생아의 뇌 피질 조직으로부터 유도 된 일차 신경교 포함 및 세포주 불멸. 그러나, 이러한 시스템은 생체 내에서 척수 신경교 세포의 특성을 반영하지 않을 수있다. 더 나은 생체 상태를 반영 배양 시스템을 이용하여 말초 신경 손상 - 유도 된 신경 병증 통증의 개발 척수 신경교 세포의 역할을 조사하기 위해, 우리 실험실에서 기본 척수 혼합 신경교 배양을 설정하는 방법을 개발했다 성인 마우스. 간단히, 척수는 성인 쥐에서 수집하고 굴과 수초 제거하여 파파인 소화를 통해 처리됩니다성만 구배 매체. 단일 세포 현탁액은 35.9 오 ℃에서 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME) 보충 완전한 둘 베코의 변형 이글 미디어 (cDMEM)에서 배양 이러한 배양 조건은 혼합 아교 세포의 성장을 위해 특별히 최적화된다. 이러한 조건 하에서, 셀 (12) 사이의 실험에 사용될 준비가 - 14 일 배양의 설립 (D 0) 후 (셀이 기간 동안 로그 단계에서 일반적 임) 및 D (21)까지의 배양 조건에서 유지 될 수있다. 이 배양 시스템은 다양한 물질 및 제제로 자극시 척수 신경교 세포의 반응을 조사하기 위해 사용될 수있다. 신경 병성 통증 외에,이 시스템은 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 포함하는 다른 질병의 폐해 반응을 연구하는데 사용될 수있다.

이 방법은 마우스 및 래트에서 모두 혼합 아교 세포를 제조 할 수있다. 세포가 마우스 척수에서 파생 된 때 문화의 D (12) 이후 개시에 12 웰 플레이트에 웰 당 평균 총 세포 수는 물론 당 약 10 만 세포와 상대적으로 안정해야한다. 이 방법에서 얻은 신경교 세포 물질 및 관심 제의 투여시 성인 척수 신경교 응답을 검사하도록 설계된 실험에 사용될 수있다. (3)가 ?...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K 조회수.  University of New England.  신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...