이 작품은 독일 연구 협회 임상 연구 (IZKF) 뮌스터에 대한 학제 간 센터 (SEED 3월 12일, SB), (DFG)에 의해 지원되었다, 셀 - 인 - 모션 우수 클러스터 (EXC 1003 - CIM), 뮌스터 대학 (SB 및 SGM에)와 그렇지 크로네-는 Fresenius 재단 (SB 및 SGM에 2012_A88)에 의해. 우리는 우수한 삽화 헤이 케 블룸 감사합니다.

동물 보호의 독일 법에 따라 실시하고 모든 동물 실험은 지방 자치 단체 ( &quot;Recklinghausen에서, 독일; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz LandesamtfürNatur, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz 노르 트라 인 베스트 팔렌&quot;)에 의해 승인되었다. 마우스 실험 1. 일반 댓글 <ol><li> 각각의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 마우스를 사용하여 모든 실험을 수행합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 쥐를 보관하고 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있도록. </li><li> 생물학적 특성은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별에 일치하는 마우스를 사용합니다. </li><li> 가능한 한 것은, 감소 수정 또는 동물 실험을 대체하려고합니다. </li></ol> 퍼콜 그라데이션 2. 준비 <ol><li> 1 ml의 10 배 PBS, 1 ML의 FCS 및 10 ml의 퍼콜와 1X PBS 19 ml의 혼합. </li><li> 인트를 수행유리관에 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 화나게. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 내피 세포 중간 및 세포 배양 플레이트의 코팅 3. 준비 <ol><li> 내피 세포 매체 : <ol><li> 500㎖의 매질의 제조 : (. 약 20 %) 100 ㎖의 PDS 400 ml의 DMEM 배지 (. 약 80 %)을 섞어, 0.25 ml의 bFGF를 (. 20 ㎍ / ml의 약 0.05 %), 0.5 ml의 헤파린 (100 μL / ㎖;. 약 0.1 %) 및 ​​0.5 ml의 pyrumycin (4 ㎎ / ㎖]. 약 0.1 %). 단지 문화의 제 2 일 내에 사용되는 세포 배양 배지 용 pyrumycin 추가. </li><li> 유리관 내의 멸균 여과 (0.2 ㎛의 필터 기공의 직경)을 수행. 그 후 4 ℃에서 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양 플레이트의 코팅 : <ol><li> 도포 액 1ml를 들어, 500 μL의 DDH 2 O, 400 μl의 콜라겐 IV (0.4 ㎎ / ㎖) 100 ㎕를 피브로넥틴 (0.1 ㎎ / ㎖)의 용액을 제조 하였다. </li><li> EAC의 전면을 덮코팅 용액으로 세포 배양 플레이트의 웰 시간. 4 ° C에서 하룻밤 접시를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 4. 분리 (MBMEC) <ol><li> 경추 탈구로 - (12 주 이전, C57BL / 6 ~ 8) (10) 성인 쥐를 희생. 그 후 PBS 5ml에 마우스 두뇌와 저장소를 분리 (경고 :! 작업 멸균). </li><li> 집게와 뇌 줄기, 소뇌 및 시상을 제거합니다. 신중하게 멸균 블로 팅 용지에 머리를 굴려 수막를 분리합니다. 결과 수막없는 forebrains를 수집합니다. </li><li> DMEM의 13.5 ml로 채워진 50 ml의 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. </li><li> 미디어 유백색이 될 때까지 10 ㎖를 피펫 후, 제 25 ㎖를 피펫으로, 조직을 말하다. </li><li> 이어서 궤도에 37 ° C에서 1 시간 동안 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 0.6 ㎖의 콜라게나 CLS2 (10 ㎎ / DMEM에서 ml) 및 0.2 ml의 DNase를 (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 혼합물로 조직 다이제스트 악수180 rpm에서 R. </li><li> DMEM의 추가 10ml를 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 조직 서스펜션과 원심 분리기에 셀을 추가했다. </li><li> 폐기 상층 액 (경고 :! 펠릿 잃을 쉽게) </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 1,000 XG에 (약. 25 배) (20 V / w %), 및 원심 분리기, 미엘린을 제거 BSA-DMEM 25 ml의 25 ml의 피펫 펠렛을 재현 탁한다. </li><li> 큰 직경 깨진 유리 파스퇴르 피펫 상부 미엘린 층 (유백색)을 폐기하고 정상적인 파스퇴르 피펫 BSA 층을 버린다. </li><li> 9 ml의 DMEM에 펠렛을 재현 탁하고 1 ml의 콜라겐 / 디스 파제를 0.1 ml의 DNase의 (최종 농도가 1 ㎎ / ㎖이다)를 추가합니다. 180 rpm에서 진탕 기에서 37 ° C에서 1 시간을위한 솔루션 다이제스트 (주의를 : 재현 탁 피펫을 사용하지 않는 - 세포가 손실 될 수 있습니다). </li><li> 소화되는 동안, 가속도, 위스콘신과, 4 ° C에서 1 시간 동안 3000 XG에서 초 원심 분리기를 사용하여 밀도 구배를 설정하는 퍼콜 용액을 원심 분리하여thout 브레이크. </li><li> 소화 세포 현탁액에 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정지를 원심 분리기. 그런 다음 상층 액을 제거하고 DMEM 2 ㎖로 펠렛을 재현 탁. </li><li> 가속 및 브레이크없이 4 ° C에서 10 분 동안 700 XG에서 퍼콜 그라데이션 원심 분리기 위에 조심스럽게 재현 탁 세포를 추가합니다. 참고 : 세포가 계면에 구름으로 볼 수 있습니다. </li><li> 약 가져 가라. 긴 멸균 된 바늘로 세포와 상간의 12 ml의 DMEM 5 ml의 새로운 50 ml의 팔콘에 넣습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에서 다시 세포를 원심 분리기. 이후 내피 세포 배지 중 펠렛을 재현 탁 (약 사용한다. 0.2 ml의 배지를 1cm 세포 배양 판의 두 표면 당). </li><li> 코팅 된 세포 배양 플레이트로부터 도포 액을 제거한다 (단계 3.2 참조), 두 개의 연속적인 세척 단계에서 멸균 PBS로 각 웰을 씻어. </li><li> 내피 세포에서 세포 배양을 유지세포 37 ° C에서 중간 및 5 % 무균 인큐베이터에서 CO 2. 모든 2~3일 매체를 변경합니다. 90 %의 합류에 분할 세포. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

혈액 - 뇌 장벽 기능 장애는 다발성 경화증의 BBB의 예를 들어 고장 광범위자가 반응 면역 세포에 의한 중추 신경계의 침략을 용이하게하고 희소 돌기 아교 세포의 만남과 파괴를 가능하게 다양한 해로운 CNS 질환의 특징이다. 허혈성 뇌졸중에서 BBB의 중단과 뇌 부종의 후속 형성 보조 경색의 성장과 환자 6의 생존율에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 나아가, 원격지에서 BBB의 변화에​​ 의해 국소 허혈성 뇌 병변의 광범위한 기능적 변화를 유도 할 수있다. 그러나, 기본 분자 메커니즘은 5 크게 알려져 있지 않다. 반면에, 기능 BMECs에서 높은 밀도와 유출 수송의 다양성은 감염성 질환에 대한 뇌의 악성 종양 또는 항생제 화학 요법으로 도움이 약물의 농도를 감소시킨다. 따라서, 뇌 혈관 바의 깊은 이해생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서는 캐리어 기능은 특히 선호 방향 (21)에 장벽 기능을 조절 할 수있는 약리학 적 제제를 개발하는 것이 요구된다. BBB의 체외 모델에서 신뢰성이 BBB에서 규제 메커니즘을 연구하기 위해 필수 불가결 한 도구입니다. 많은 불사 화 뇌 내피 세포주 확립 및 체외 BBB 모델 (22)로서 사용되어왔다. 그들은 빠르게 성장하고 여러 통로를 통해 특정 BBB 특성을 유지 이들 세포주는 차 BMECs을 통해 어떤 이점을 제공합니다. 그러나 내피 세포 라인은 완전히 생체 내 상황에 대한 실험 결과의 양도와 섞이는 등의 중요한 속성이 변경 일차 전지를 대체 할 수 없습니다. 예를 들어, 뮤린 뇌 내피 세포주 bEnd.5 높은 parac 선도 불연속 분산 꽉 접합 단백질 만 낮은 수준을 발현ellular 투과성 (23). BEnd.3 다른 자주 사용되는 뮤린 뇌 내피 세포주, 치밀하고 연속 분산 견고 연접, 높은 저항 transendothelial 여러 유출 수송차와 낮은 세포층 투과성을 보여준다. 일차 BMECs 특정 세포 횡단 및 세포층의 기판 (24)의 투과에 대하여 실제 차별 부족하지만 bEND.3 셀 층 비해. 차 세포 배양의 준비에서 오염 세포는 크게 실험 결과의 타당성을 방해 할 수 있습니다. 내피 세포는 높은 순도를 달성하기 위해 기술 된 프로토콜에 pyrumicin은 선택적 제로서 사용된다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양의 일반적인 품질 관리 불가피 신뢰성 실험 보장하는데 필요하다. 내피 세포의 전형적인 형태 학적 특성 (도 1a 참조), transendothelia 게다가 품질 제어를위한 여러 가지 방법이있다L 저항을 측정 할 수있는 또는 같은 CD31와 같은 내피 세포 마커의 발현 (그림 1B 참조) 또는 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의)가 평가 될 수 있습니다. 한 마우스 뇌로부터 단리 뇌 내피 세포의 수가 상대적으로 낮은 여러 실험에 적합한 세포 배양을 설정하는 등의 여러 쥐의 뇌를 풀링 할 수있다. 우리의 경험에서, 적어도 10 마우스는 각 동물 시설의 자원에 따라 제한적인 요소가 될 수있는 하나의 실험을 위해 사용되어야한다. 바이어스 또는 교란 요인을 피하기 위해, 동일한 유전 적 및 환경 적 배경 만 마우스 풀링한다. 반대로, 소 및 돼지의 뇌 내피 세포 제제는 하나의 뇌에서 사용할 뇌 내피 세포의 다수를 제공한다. 그러나, 복잡하지 않은 번식과 주택, 가능한 형질 전환 마우스의 광범위하고 계속 증가하는 레퍼토리 외에 주 쥐 BMECs 이상적인로 렌더링모델은 혈액 - 뇌 장벽의 기능을 연구합니다. BBB 및 기본 분자 메커니즘의 기능에 관한 몇 가지 주요 연구 결과는 2 차원 조직 배양 시스템의 연구에서왔다. 최근, 3 차원 배양 시스템은 내피 세포 루멘 관 네트워크를 형성 할 수 있도록 콜라겐 매트릭스 내에 배치된다 (25)이 개발되어왔다. 이러한 새로운 세포 배양 시스템은 생체 내에서 혈관 손상 유기체 프로세스 더욱 정확한 재생산을 허용. 이러한 혈관 주위 세포와 성상 세포로 NVU 3 차원 세포 배양 시스템의 추가 세포의 참여는 혈액 - 뇌 장벽 기능의 공부 체외 혁명 있습니다; 제 모델은 최근 26 개발되었다. 문제 해결을위한 몇 가지 권장 사항이 있습니다. 모든 멸균 작업의 첫 번째는 내피 세포 배양의 품질에 필수적이다. 둘째, pyrumycin는 셀을 추가해야합니다배양의 처음 2 일 내에 사용되는 배지는, 응용 프로그램은 더 이상 증가 MBMEC 세포 사멸과 낮은 품질의 장벽 기능을 초래할 수있다. 셋째,이 프로토콜에 적용될 효소 제조업체의 지시에 따라 사용 및 저장되어야한다; 그렇지 않으면 자신의 적절한 기능이 손상 될 수 있습니다. 내피 세포 부착하지 않는 경우 또한, 세포 배양 판의 코팅은 개정 될 수 있습니다. 피브로넥틴 및 콜라겐의 농도가 변경되게 또는 다른 기질 단백질이 코팅 용액에 첨가 될 수있다. 마지막으로, 연령, 성별, 동물 시설 내의 연도와 환경 조건의 계절 MBMEC 분리 실험의 비교의 품질에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 이 조건이 독립적 인 실험과 비교할 수 있는지를 확인해야한다. 기술 된 프로토콜은 뮤린 BMECs을 분리하는 기본적인 neuroimmunological 방법으로 고려되어야한다. 분리 된 세포는 U이 될 수 있습니다이러한 마이그레이션 분석법, 유전자 및 단백질 발현 연구, 또는 전기 생리 학적 평가 투과성 실험 등 BBB 기능에 추가 통찰력을 얻기 위해 다양한 애플리케이션을위한 나오지. 전술 한 바와 같이, 3D BMECs의 세포 배양 시스템은 NVU의 맥락에서 BBB의 조절에 관여 복잡한 메커니즘을 연구하기위한 새로운 기회를 제공 할 수있다. 따라서, 차 내피 세포의 분리는 향후 BBB 연구 분야에서 매우 중요한 기술에 남아있을 것이다.

<html> 고도로 전문화 된 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 일부입니다 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMEC) 형태의 단일 층. BMECs은 기저막에 부착 접합부 단백질에 의해 서로 연결되어있다. 함께 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 교세포 단부 피트와 순환 혈구 그들은 소위 신경 혈관 부 (NVU)를 하나 구축. 혈액과 중앙 신경계 (CNS) 간의 불 투과성 장벽의 이전의 개념에 대하여, NVU은 뇌 혈관 및 CNS (2) 사이의 유체 분자와 세포의 전이를 제어하는 동적 고도로 특이적이고 규제 인터페이스 . NVU의 장애 또는 이상 조절이 개시 및 / 또는 허혈성 뇌졸중, HIV-뇌증, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 또는 파킨슨 병과 같은 3-6 CNS의 신경 혈관, 감염성 염증성 또는 퇴행성 질환의 종류에 기여할 수있다. _content &quot;&gt; BMEC 단층 단단히 꽉 (TJ)로 구성 접합부 복잡한에 의해 밀봉되어 (AJ) 7. 높은 전기 저항과 BBB의 낮은 세포층의 투과성은 주로 TJ 단백질을 기반으로 접합 8. TJS은 adherens 이러한 zonulaoccludens (ZO) 단백질과 같은 어댑터 분자에 의해 내피 세포의 세포 골격에 연결되어 클라우딘 및 occludin 가족 경막 단백질에 의해 형성된 복합체 ZO1-3 4 Adherens 접합은 주로 막 관통 단백질에 의해 조립된다. catenins (8)를 통해 세포 골격에 연결되어 혈관 내피 세포 (VE) -cadherin. BBB의 기밀 유지는 혈액과 뇌척수액 사이의 기판과 세포의 무료 교환을 방지 할 수 있습니다. 이 규칙에 예외가 지질 매개 확산 9 BBB를 통과 할 수있는 분자량 &lt;400 다와 친 유성, 작은 분자이다. 통로의 더 큰 및 / 또는글루코스, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 많은 약물 친수성 분자는 다섯 가지 주요 범주로 분류 될 수 고도로 제어 된 세포 횡단 운송 시스템 (10)으로 제한된다 : 캐리어 매개 수송, 이온 수송 활성 유출 수송 수용체 매개 전송 및 카베 올래 매개 교통편 4. 이러한 수송 시스템은 정확한 신호 생성, 전달 및 통합에 필요한 CNS의 항상성을 유지하는 데 도움. 더욱이 BMECs 적극적 ectoenzymes의 다양한 표현에 의해 구별 분자의 전환을 제어 할 수있다. 이러한 효소 저해 또는 BBB (11)의 전환을 가능하게 특정 내인성 및 외인성 기질 세포 표면 상에 집중하고 수정할 수있다. CNS는 오랜 시간 동안 면역 권한 기관으로 간주 된 반면, 최근의 연구 결과는 면역 surv의 다소 역동적이고 엄격하게 규제 시스템을 제안CNS의 eillance. BMECs 비판적으로 면역 세포 윤회의 조절에 관여한다. 그들의 표면 림프구에 셀렉틴의 발현에 의해 선택적으로 느슨하게 내피 세포에 부착하도록 유도한다. 백혈구의 특정 수용체​​ 발생할 케모카인의 분비 발현 또는 LFA-1과 백혈구 인테그린의 구조 변화, 리드 (림프구 기능 관련 항원 1) 및 VLA-4 (매우 늦은 항원 -4). 인테그린 사이 또는 BBB 12-14 BMECs 통해 뇌 실질 내로 이주 있도록 그들의 내피 counterreceptors, 예를 들면 VCAM-I (혈관 세포 부착 분자), ICAM-I (간 부착 분자)를 결합함으로써 밀착성을 매개한다. 이들 및 다른 연구 결과는 면역 세포의 이동을 조절하는 내피 세포 자체의 적극적인 역할을 강조한다. 또한, BMECs NVU의 일부 뇌 혈류 리튬의 조절에 관여 된 바와지역 신경 세포의 신진 대사 요구에 nked. 성상 세포 자극시 내피 세포는 혈관 평활근 세포 (15)의 이완에 산화 질소로 혈관 활성 물질을 생산한다. 현상뿐만 아니라 성인 뇌 쇼 평행 패터닝 및 개발 및 규제 1,4 많은 속성을 공유하는 신생 혈관 형성 및 신경. 내피 세포는 비판적으로 이러한 프로세스 (16), (17)에 참여하고 있습니다. 요약하면, BMECs는 CNS의 적절한 개발과 기능을 보장하기 위해 필수적인 기능을 제공합니다. BBB 장애는 많은 심각한 신경 학적 장애에 연결되어 있습니다. 그러나, 매우 소수의 대상은 특정하고 효율적인 치료 18 뇌 혈관계 계면에서 확인되었다. 시험 관내 모델에서 간소화가 싸다 대한 함수 복잡한 생리 학적 시스템의 조절에 관여하는 메커니즘을 이해하는 데 사용되어왔다NG 시간. 이 원고와 쥐의 BMECs의 체외 연구에 의해 설명 된 특정 마우스 녹아웃-균주의 다양한 주어진 격리, 새로운 치료 길을 열어 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 BBB 기능 및 규제의 또 다른 이해를 제공 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

즉시 차단 후, 뮤린 BMECs 및 오염 세포를 세포 배양 배지 (도 1A, 0 일)에 떠 대기업을 형성한다. 그들은 이러한 독소에 대한 상대 저항에 이르는 P는 당 단백질로 유출 수송의 높은 수준을 표현하기 때문에 pyrumycin과 치료는 쥐의 BMECs의 선택으로 이어집니다. 오염 세포 매개 세포 독성 (19) pyrumycin 훨씬 더 민감하다. MBMECs는 콜라겐 IV / 피브로넥틴 코팅 된 세포 배양 판 (그림 1A, 1 일 및 2 일)에 부착하기 시작하는 반면 pyrumicin 선택의 과정에서 오염 세포는 세포 사멸 또는 괴사 세포 사멸을 입력합니다. 5 일까지, MBMECs 약의 밀도로 증식. 80~90%. 이들은 전형적인 방추형 외관을 특징으로한다. 합류, 그들은 단단히 세로 방향으로 정렬, 포장 및 비 중복 접촉 억제 세포 (그림 1A, 5 일)의 단일 층을 형성한다. 로(; 그림 1B PECAM1) 내피 세포 마커 CD31에 의해 입증 된 바와 같이 pyrumicin 선택, 최대 99 % MBMEC의 높은 순도에 도달. MBMECs 단단히 꽉 접합 단백질에 의해 상호 연결 밀봉 된 단일 층을 형성한다. 7 후 - 문화의 8 일, 내피 세포 층은 전기 저항에 대한 안정적인 값을 구축 (20 사이의 전형적인 값에 도달 - Ω (30)를 X cm 2). 및 커패시턴스 (그림 1C)이 시간 시점에서 기능 분석 등의 세포 -로 에반스 청색 또는 덱스 트란과 함께 예 : 이주 실험 3, 20, 21 및 투과성 시험은 수행되어야한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 형태 학적 및 설치류 BMECs의 기능적 특성. 투과광 마이크로 볼 배양 BMECs의 (A) 주제 경시이상 오일 SCOPY. 스케일 바는 모든 이미지에 적용됩니다. 내피 세포 마커 CD31에 대한 (B) 면역 형광 염색을 하루 5 CD31 (녹색) 및 DAPI (파란색)에서. (C) 세포 5 일 동안 예비 배양 한 후위한 자동화 된 시스템으로 전송되었다 생물 물리학 적 특성 (저항 및 정전 용량)의 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K 조회수.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

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Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

기본 Murine 골격 근육 Microvascular 내 피 세포의 고립

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.