당사의 프로토콜은 풀다운 분석 분석 크기 배제 크로마토그래피, 분석 초원심분리 및 히스톤 샤페론 분석과 같은 기술을 사용하여 단백질이 히스톤 샤페론인지 여부를 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 다루는 기술은 탠덤을 사용할 때 추정 보호자를 특성화하는 데 직접 적용될 수 있습니다. 그의 구조 생물학 기술과 함께 갈 수 있습니다.
이 기술은 염색질 연구 분야에 적용 할 수 있습니다. 그러나, 개별 방법은 필요에 따라 임의의 다른 관심 단백질에 적용될 수 있다. 절차를 시연하는 것은 복잡한 풀다운 분석을 위해 내 실험실의 박사 과정 학생인 Mr.Surajit Gandhi가 될 것입니다.
Archana Samal, 박사 과정 학생, 분석 초 원심 분리 실험을위한 Ruchir C.Bobde 씨, 박사 과정 학생 Somanath Baral, 플라스미드 슈퍼 코일 링 분석을위한 Ketul Saharan 씨와 함께 먼저 5 마이크로 몰 히스톤 샤페론과 20 마이크로 몰 H2A / H2B 이량 체를 300 마이크로 리터의 평형 완충액에 혼합합니다. 히스톤 샤페론 H2A/H2B 복합체를 원심분리하여 침전물을 제거합니다.
평형 버퍼로 미리 평형화된 스핀 컬럼에 샘플을 로드합니다. 컬럼을 100 컬럼 부피 또는 4밀리리터의 세척 완충액으로 세척하여 과도한 H2A/H2B 이량체를 제거합니다. 다음으로, 히스톤 샤페론 H2A / H2B 복합체를 20-60- 마이크로 몰 H3 / H4 사량 체와 혼합합니다.
컬럼을 100 컬럼 부피 또는 4밀리리터의 세척 완충액으로 재세척하여 결합되지 않은 H3/H4 사량체를 제거한 다음 용리 완충액으로 샘플을 용리합니다. 용리된 샘플을 18%SDS-PAGE에 적용합니다. 그런 다음 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색하고 젤을 시각화합니다.
분석 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 투석 완충액으로 히스톤 샤페론의 H2A / H2B 이량 체, H3 / H4 사량 체를 개별적으로 정제합니다. 나중에 추가 희석을 준비하고 AUC 셀에서 참조로 사용하기 위해 실행에서 버퍼를 저장합니다. AUC 샘플의 경우, 정제된 샤페론을 별도의 튜브에서 이량체 또는 사량체와 혼합하여 0.3 내지 0.6의 OD280에 도달하기 위해 저장된 투석 완충액을 사용하여 최종 부피 450마이크로리터까지 혼합합니다.
흡광도 검출기가 있는 분석 초원심분리기와 함께 제공되는 이중 섹터 센터피스와 석영 창으로 셀을 조립합니다. 400 마이크로리터의 샘플 용액과 420 마이크로리터의 투석 완충액을 각각 셀의 기준 및 샘플 섹터에 채웁니다. 셀의 무게를 측정하고 정확하게 균형을 잡고 4홀 티타늄 로터에 로드합니다.
셀과 로터의 맨 아래에 있는 표시를 사용하여 셀을 정렬합니다. 로터를 원심 분리기에 넣고 뚜껑을 닫은 다음 실행을 시작하면 진공이 발생하고 온도가 안정화됩니다. 데이터 분석을 위해, 단백질 완충액 성분에 대한 밀도 및 점도 및 부분 비부피 프로그램을 사용하여 단백질의 아미노산 조성을 기준으로 계산한다.
AUC 시스템에서 SEDFIT 프로그램으로 데이터를로드하십시오. 메니스커스, 빨간색 선, 셀 하단, 파란색 선 및 데이터 분석 경계 녹색 선을 정의합니다. 연속 CS 분포를 모델로 선택합니다.
매개 변수 섹션에서 해상도 최대값을 최대 100으로 설정합니다. 다음으로 침강 계수 최소값을 0으로, 최대값을 10에서 15로 설정합니다. 처음에는 마찰비를 1.2로 설정하고 부동 비율을 선택하여 데이터에서 비율을 도출합니다.
1 시그마 정규화에 대해 F-비율을 0.68로 설정합니다. SEDNTURP에서 얻은 부분 특정 부피, 버퍼 밀도 및 점도를 설정합니다. Run을 눌러 소프트웨어가 lam 방정식을 풀도록 허용합니다.
맞추기를 눌러 구체화합니다. 기본 도구 모음의 표시 기능에서 CS에 피크 Mw 표시를 선택하여 분자 질량을 추정합니다. 2 마이크로 몰 H3 / H4 사량 체와 4 마이크로 몰 H2A / H2B 이량 체를 조립 버퍼에서 1에서 6 마이크로 몰 범위의 히스톤 샤페론 농도를 증가시켜 최종 부피 50 마이크로 리터까지 혼합합니다.
혼합물을 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양한다. 동시에, 50 마이크로리터의 최종 부피에서 500 나노그램의 음성 슈퍼코일 PUC-19 플라스미드를 조립 완충액 중의 1 마이크로그램의 토포이소머라제 I 효소로 전처리한다. 다음으로, 사량체, 이량체 및 히스톤 샤페론을 포함하는 사전 혼합 용액을 이완된 혈장 DNA와 결합합니다.
100 마이크로리터의 2X 정지 완충액을 추가하고 배양하여 플라스미드 DNA를 탈단백질화하여 조립 반응을 종료합니다. 반응 혼합물을 포함하는 튜브에 동일한 부피의 트리스 포화 페놀을 추가하고 반응 혼합물의 내용물을 잘 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 원심분리합니다.
플라스미드 DNA를 함유하는 상부 수성상을 마이크로피펫으로 부드럽게 수집하고 동일한 부피의 클로로포름을 혼합한다. 혼합물을 소용돌이. 다음으로, 상부 수성 상을 수집하고, pH 5.5의 3 몰 아세트산 나트륨 1/10 부피 및 얼음처럼 차가운 에탄올 2.5 부피를 첨가한다.
튜브를 3-4 번 뒤집어 용액을 잘 섞는다. 샘플을 16, 200 G에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 부드럽게 버린다. 미량의 에탄올이 증발 할 때까지 튜브를 실온에서 열어 두어 침전 된 플라스미드 DNA를 튜브에 남겨 둡니다.
분석 SEC 결과는 애기장대 단백질 FKBP53의 재조합 N- 말단 뉴 클레오 플라스 민 도메인이 용액에서 65 킬로달톤의 펜타 머임을 밝혀 냈습니다. 열처리를 거친 뉴 클레오 플라스 민 샘플은 도메인이 매우 열 안정성임을 보여 주었다. 뉴 클레오 플라스 민 도메인은 최대 2 개의 몰의 염화나트륨 및 최대 4 개의 몰 모양의 요소 안정성을 나타 냈습니다.
풀다운 분석에 따르면 뉴클레오플라스민 도메인과 H2A/H2B 이량체의 상호 작용은 0.4몰 염화나트륨까지 안정적인 반면 H3/H4와의 연결은 최대 0.7몰까지 안정적이었습니다. 샤페론은 샤페론에 첨가되는 순서에 관계없이 H2A/H2B 이량체와 H3/H4 사량체를 동시에 결합하여 올리고머에 대한 별도의 상호 작용 부위를 나타냅니다. AUC-SV를 통해 추정된 분자 질량은 히스톤 올리고머가 있는 뉴클레오플라스민 도메인의 1:1 화학량론을 나타냅니다.
플라스미드 슈퍼 코일링 분석에서 재조합 식물 히스톤 샤페론 AtNRP1 및 AtNRP2는 슈퍼 코일 플라스미드의 양을 증가시켜 DNA에 히스톤을 침착시켜 뉴클레오솜을 형성하여 DNA 슈퍼 코일링을 유발할 수 있음을 시사합니다. 플라스미드 수퍼 코일링 분석은 히스톤 DNA 및 샤페론 특성 분석을 위해 특별한 주의와 가능한 최적화가 필요합니다. 아이소머 특성화 텔레메트리는 결합 안정성을 확인하기 위한 분석 크기 배제 실험의 후속 조치로 사용할 수 있습니다.
