여기에 포함 된 의견이나 주장은 저자의 개인 전망이며, 공식 또는 육군의 부 또는 국방부의 의견을 반영하는 것으로 해석되어서는 안됩니다. 저자 휘트니 A. 그린, 알베르토 Muñiz 및 라 메쉬 R. Kaini가 USAISR에 국가 연구위원회 박사 학위 취득 후 연구 Associateship를 개최하면서이 연구를 수행 하였다. 마이크로 어레이 분석은 Greehey 어린이 암 연구소 마이크로 어레이 핵심 시설 및 UT 건강 과학 센터 샌 안토니오에서 생물 정보학 부서에 의해 수행되었다. 이 작품은 미국 육군 임상 재활 의학 연구 프로그램 (CRMRP) 및 군사 운영 의학 연구 프로그램 (MOMRP)에 의해 지원되었다.

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비 <ol><li> mTeSR1 미디어 : 제조업체의 지시에 따라 mTeSR1 미디어를 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 mTeSR1 배 보충 100 ㎖를 해동 mTeSR1 기초 미디어 400 ㎖에 mTeSR1 배 보충의 100 mL를 넣고 잘 섞는다. 이 매체는 최대 2 주 동안 4 ° C에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다. </li><li> 차별화 미디어 : 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 0.1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2.0 밀리미터 L-글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 등을 산출하기 DMEM/F12에서 차별화 미디어를 준비합니다. </li><li> IPS-RPE 미디어 : 1X N1 보충, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ㎖의 타우린, 13 NG / ML 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염, 20 NG / ML의 하이드로 코티손, 5 μg을 산출하는 MEM에서 IPS-RPE 미디어를 준비 / ml의 겐타 마이신, 및 15 % FBS (26). </li><li> 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 염 원액. 스톡 용액을 제조 트리 요오도-L-티 로닌 1.0 MG 녹여온화 소용돌이 1 N 수산화 나트륨 중의 나트륨 염. 다음 트리 요오도-L-티 로닌 나트륨 소금의 20 ㎍ / ㎖의 50.0 ㎖로 만들어베이스 미디어의 49.0 ML을 추가합니다. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배양 배지에 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 하이드로 코티손 원액 : 하이드로 주식 솔루션을 준비 부드러운 교반 무수 에탄올 1 ㎖에 하이드로 코티손의 1 밀리그램을 용해합니다. 다음 50 ㎍ / ㎖를 20 ㎖의 하이드로 코티손 원액에 대한 기본 미디어의 19.0 ML을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 동결 필요할 때까지. 최종 배양 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 볼륨을 사용합니다. </li><li> 태아 RPE 성장 배지. FBS를 제외하고 제조 업체의 지시에 따라, 기초 미디어 RTEGM 키트의 모든 시약을 혼합하여 성장 미디어를 준비합니다. </li><li> 태아 RPE 도금 미디어. 무균 용기로 성장 배지의 소량을 전송함으로써 도금 매체를 준비2 %의 최종 농도 DD 형식 FBS. </li><li> 디스 파제 : DMEM/F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 리겔 코팅 플레이트 : 0.08 ㎎ / ㎖로 DMEM/F12에 리겔을 준비합니다. </li><li> 코트 각 마트 리겔 솔루션의 1.0 ML과 6 잘 플레이트 잘. </li><li> 1.0 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 배양한다. </li><li> 1.0 시간 배양 한 후, 초과 DMEM/F12를 대기음. </li><li> 건조를 방지하기 위해 mTeSR1 매체의 0.5 ML을 추가합니다. 리겔 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되어 있습니다. </li></ol> 2. 만능 문화 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 모든 튜브, 실내 온도에 따뜻한 mTESR1 미디어, 준비 리겔 코팅 플레이트가 있습니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-4 iPS 세포를 해동. 그 후 수조에서 cryovial을 제거하고 70 % 에탄올을 이용하여 살균. </li><li> 세포 집합체의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖ 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 드롭 현명한 주 5 ㎖를 추가RM 부드럽게 mTeSR1의 세포 미디어와 혼합. 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 mTeSR1 미디어 2 ㎖의 세포 집합체를 재현 탁하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 세포를 씨앗. </li><li> 5 % CO 2, 95 %의 습도가 37 ° C의 배양기와 문화에 접시를 놓습니다. </li><li> 매일 만능 줄기 세포 배양 매체를 변경합니다. 미분화 식민지 5-7 일 파종 한 후 나타납니다. 통로 (조밀 센터와 식민지)에 대한 준비가되어 획일적 인 식민지를 확인합니다. </li></ol> iPS 세포의 3.과 Passaging <ol><li> 종래 통로 처음 IPS 세포가 모두 튜브, 디스 파제 용액 DMEM/F12와 mTERS1 미디어 실온으로 가온하였으며, 마트 리겔은 판이 준비 코팅. </li><li> iPS 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 미디어를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 차별화에 대한 높은 웰의 20 % 미만으로 유지해야한다양질의 문화. 조심스럽게 유도 만능 줄기 세포 함유 아니라 2 ML의 DMEM/F12를 세척하고 각 웰에 1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 디스 파제를 대기음 부드럽게 두 번 DMEM/F12 2 ㎖의 세포 식민지를 씻어. </li><li> 세척 한 후, 각 웰에 mTSER1 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 5 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 집계를 형성하기 위해 판의 식민지를 다 쳤어요. </li><li> 15 ML 원뿔 관에 분리 된 식민지를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 배정하는 충분한 mTeSR1 미디어를 추가합니다. </li></ol> IPS-RPE에 iPS 세포 4. 차별화 <ol><li> mTESR1 미디어에서 새로 코팅 된 플레이트에 iPS 세포를 접시. </li><li> 유도 만능 줄기 세포 식민지 문화에 4 ~ 5 일 확장 할 수 있습니다. </li><li> 4 ML 차별화 미디어 대체 mTeSR1 미디어. 3 일마다 미디어의 절반을 변경합니다. </li><li> 색소 초점은 (40~50일) 수동으로 문화 밖으로 해부 할 수있을만큼 커질 수 있습니다. </li><li> 을 사용하여200 μL 피펫 팁 주변에 잘라 색소 식민지를 들어 올립니다. </li><li> 수집하고 15 ML 원뿔 관에 해부 식민지를 풀. </li><li> 그런 다음 두 번 5 분 300 XG에 풀링 된 RPE 세포와 원심 분리기에 DMEM/F12 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 0.25 % 트립신 EDTA와 풀링 된 IPS-RPE를 배양하여 단일 세포의 솔루션을 준비합니다. </li><li> IPS-RPE 매체와 IPS-RPE 세포를 씻어에 수집 된 세포를 접시 신선한 리겔 코팅 IPS-RPE 미디어의 4 ㎖에 잘. </li><li> 문화 이전의 통로에 3 주 동안 세포. 3 일마다 미디어를 변경합니다. 실험의 경우, 플레이트 IPS-RPE / ㎠ 100,000 세포에서. 일 17 일에 세포를 수집합니다. 일 0으로 파종의 날을 계산합니다. </li></ol> 5. 시료 채취 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 컬렉션 <ol><li> 문화 iPS 세포 분화 식민지가 중앙에 밀집 것으로 관찰 될 때까지. </li><li> DMEM/F12에 식민지를 씻어. </li><li> accutas를 사용하여 단일 세포로 해리<html> 전자. 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 세포를 수집합니다. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁. </li></ol></li><li> 태아 RPE 컬렉션 <ol><li> DMEM/F12와 태아의 망막 색소 상피 세포 배양을 씻어 0.25 % 트립신 EDTA를 사용하여 단일 세포로 해리. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기. 기음 뜨는. DMEM/F12 2 ㎖에 재현 탁. </li></ol></li><li> IPS-RPE 세포 컬렉션 <ol><li> IPS-RPE는 통로 (3)과 통로 (5)에 도달하면 통과 후 17 일째에 세포를 수집합니다. 두 번 PBS에서 IPS-RPE를 씻어 1.0 ㎖를 0.25 % 트립신과 배양하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 차가운 얼음 IPS-RPE 미디어 2 ㎖와 트립신을 중화. </li><li> 5 분 300 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에있는 세포를 수집합니다. 기음 뜨는. </li><li> 마이크로 비드 키트에서 염색 완충액 3 ml의 세포 현탁액을 재현 탁. </li></ol></li></ol>미분화 세포를 제거하는 IPS-RPE의&gt; 6 ve_title &quot;. 부정적인 선택 <ol><li> 사용할 때까지 4 ° C에서 모든 시약을 유지하지만 얼음에 작동하지 않습니다. 5 분 300 XG에 단계 5.3.4에서 원심 분리기 세포 현탁액. 기음 뜨는. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 마이크로 비드 키트에서 염색 버퍼 100 μL의 세포를 Resuspend. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 안티-TRA-1-60-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어서 10 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 버퍼의 1-2 ml의 세포를 씻으십시오. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는. </li><li> 2 × 10 6 세포 당 염색 버퍼 80 μL의 세포를 Resuspend. 2 × 10 6 세포 당 방지 PE 표지 마이크로 비즈 20 ㎕ (키트)를 추가합니다. 잘 섞는다. 4 ℃에서 15 분 동안 품어 </li><li> 2 × 10 6 세포 당 버퍼를 얼룩의 1-2 ML을 추가합니다. 300 X g에서 10 분 원심 분리기. 기음 뜨는. </li><li> 500 &amp; # 세포를 재현 탁956, 염색 버퍼의 L. </li><li> 자기 세포 분리 : <ol><li> 자기 세포 분류기에 열을 놓습니다. 염색 버퍼의 3 ㎖로 컬럼을 씻어. </li><li> 칼럼에 6.8에서 세포 현탁액을 적용합니다. </li><li> TRA-1-60 음성 세포를 수집하는 부정적인 포트에 튜브를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 7. 총 RNA 추출 <ol><li> 를 Lyse 핵산 minipreps 위해 고안된 시판의 microcentrifuge 균질 소형 스핀 칼럼을 통해 샘플을 실행하여 셀. </li><li> iPS 세포, IPS-RPE, 작은 RNA 분자 (27)를 유지하도록 설계 시판되는 RNA 추출 키트와 태아의 망막 색소 상피에서 총 RNA를 추출합니다. </li><li> Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 결정합니다. </li></ol> 8. Bioanalyzer 및 마이크로 어레이 분석 <ol><li> 상업적으로 이용 가능한 RNA 품질 키트와 함께 Bioanalyzer와 RNA의 무결성을 확인합니다. </li><li> 100 NG의를 품어30 분 동안 37 ° C에서 송아지 장 포스와 총 RNA </li><li> 5 분 동안 100 ° C에서 100 % DMSO를 사용하여 RNA를 변성. </li><li> PCP-Cy3에 1 시간 동안 16 ° C에서 배양 T4 리가 아제를 사용하여 함께 샘플을 레이블. </li><li> 8_x_15K 형식 인간 miRNA의 배열에 하이브리드. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 배열을 세척하고 스캐너를 사용하여 5 ㎛의 해상도로 스캔 할 수 있습니다. </li><li> 의 miRNA 마이크로 어레이와 호환 마이크로 어레이 피쳐 추출 소프트웨어를 사용하여 데이터를 획득. </li><li> 각 샘플의 발현의 상대적 수준을 결정하는 miRNA의 신호를 처리한다. </li><li> 샘플 그룹 사이에 각각의 miRNA의 발현 수준을 비교합니다. 추가 분석을 위해 적어도 두 가지 차등 식의 miRNA를 선택합니다. </li><li> 차별적 표현의 miRNA (28)의 시각화를위한 히트 맵을 생성하는 지침에 따라, 데이터 분석을위한 상용 소프트웨어를 사용하여. </li></ol> 9. 경로 분석 <ol><li> 엑셀 형식으로 8.9 선택의 miRNAs의 데이터를 저장합니다. </li><li> 온라인 RNA 경로 분석 프로그램에 로그인합니다. Excel 파일을 업로드 할 수 있습니다. 파일 형식에 대한 &quot;유연한 포맷&quot;을 선택하고 식별자 유형 드롭 다운 목록에서 &quot;애질런트&quot;를 선택합니다. </li><li> 원시 데이터의 제목 아래, ID 열을 조사하는 &quot;ID&quot;를 지정하고 &quot;관측 1&quot;을 지정하고 로그 배급 열에 &quot;비율을 기록&quot;. 다른 모든 열은 &quot;무시&quot;를 선택합니다. </li><li> 다음과 같은 분석을위한 매개 변수를 선택 : 신뢰 : 실험적으로 만 관찰; 직접 및 간접 관계를 포함한다; 내인성 화학 물질을 포함한다; 기준 세트로 독창성 기술 자료를 선택합니다. 모든 종에서 데이터, 모든 세포주 및 조직, 모든 돌연변이를 포함 참조 분자의 데이터베이스를 선택. </li><li> 실행 네트워크와 경로 분석. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).</li><li>Neveu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+reveals+two+distinct+p53-related+human+pluripotent+stem+cell+states.">MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states.</a> Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li><li>Qiagen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNeasy+Mini+Handbook.">miRNeasy Mini Handbook.</a> Sample and Assay Technologies. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+System+with+miRNA+Complete+Labeling+and+Hyb+Kit.">Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit.</a> Agilent Technologies. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+hESCs+and+hiPSCs+in+mTESR1+and+mTESR2.">Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2.</a> Stem Cell Technologies. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Analysis+of+DNA+or+RNA+using+its+wavelengths:+230+nm,+260+nm,+280+nm.">The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm.</a> About Biotechnology. , (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

결론적으로,이 보고서는 문화 iPS 세포를 사용하는 방법, IPS-RPE, 태아 RPE에 대해 설명합니다. 만능 줄기에서 파생 된 RPE는 형태 학적 및 기능적으로 태아의 망막 색소 상피와 비슷합니다. IPS-RPE는 RPE65, CRALBP, PEDF 및 LRAT 16 등의 특성 RPE 유전자를 표현한다. 추가로 이들 세포를 특성화하기 위해, RNA를 추출하고 차분 miRNA의 발현을 확인하기 위해 마이크로 어레이 분석을 수행하는 데 사용되었?...

줄기 세포는 한계 및 체세포 형태로 분화 할 가능성없이 복제하는 능력이있다. 개인 조직 재생의 출현은 수평선 1에 그대로 만능 줄기 세포로 체세포를 재 프로그램하는 기술의 개발, 지역 사회 연구와 임상의 사이에 큰 흥분을 유발하고있다. 줄이고 ESCs와 관련된 윤리적 딜레마를 회피하면서 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (ES) 세포 배아 줄기으로 무제한 증식하는 잠재력과 능성의 동일한 기능을 나타낸다. 또, 환자 유래의 줄기 세포는 매우 성공적인 치료 응용 2-3의 확률을 증가, 면역 반응을 자극하지 않을 것이다. 특정 배양 조건에서, iPS 세포는 심근, 신경 세포, 췌장 베타 세포, 간세포, 망막 색소 상피 세포 (RP 등의 체외에서 여러 가지 다른 종류의 세포로 분화하는 것으로 나타났다E) 4-12. RPE는 생산 전문 같은 감광체 외측 세그먼트 미광, 식균의 흡수와 같은 카메라 기능과 건강에 필수적인 여러 가지 기능을 수행 망막의 뒤쪽에 위치하고 색소 상피 세포의 층 및 레티노이드 가공 발색단의. 연령 관련 황반 변성 (AMD), 스타 르가 르트 병, 및 망막 색소 상피 변성증 (RP)와 같은 기본 RPE 병리의 결과 눈부신 질병에 의해 입증 손상 또는 질병에 RPE의 장애 뿌리깊은 광 수용체의 건강과 시각 기능에 영향을 미치는 13. 비전을 복원 할 수 있습니다 참으로 효과적인 치료법이 달성되지 않은, 건강한 RPE와 병에 걸린 RPE의 교체는 비전 14-15의 손실을 방지하는 가장 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 의 IPS (IPS-RPE)에서 파생 된 RPE는 손상된 RPE를 대체하는 세포의 가능한 소스입니다. IPS-RPE는 비슷한 특징을 표현TIC RPE 단백질 LRAT, CRALBP, PEDF 및 RPE65; 고전 높은 색칠 육각 RPE의 형태를 표시합니다; CIS 망막 5,16 -와 같은 식균 작용, 레티노이드 처리, 및도 11의 분비와 같은 RPE 기능을 수행한다. IPS-RPE는 치료를 사용하기 전에 그러나, IPS-RPE 철저을 특징으로합니다. RPE의 분화를 제어하는​​ 요인을 이해하는 것은 임상 응용에 사용되는 세포의 수율 및 순도를 향상시킬 필요가있다. 세포 분화는 고도로 조절 유전자 발현의 결과이다. 전사 인자의 게놈과 조정의 성적인 리모델링은 차별화 및 개발 (17) 중에 발생하는 세포의 운명 결정에 필요합니다. 마이크로 RNA (miRNA의)에 의해 메시지 RNA (mRNA의) 번역의 규정은 세포의 운명 1에 영향을 미치는 규제의 또 다른 레벨을 제공합니다. 의 miRNAs는 짧은 ~ 22 NT, 뉴클레오티드의 길이가 억제 번역에 의해 하나의 mRNA의 3 &#39;UTR에 결합 또는 변형의 mRNA를 표적으로한다. 의 miRNAs는 거의 모든 조직에서 검출 된 현재까지 2,000 개 이상의 독특한 인간 마이크로 RNA는 miRBase 데이터베이스에 등록되었습니다. 즉, 하나의 mRNA는 여러 가지의 miRNA 대상이 될 수있는 miRNA 대상의 mRNA에 결합하는 부분적인 보완을 요구하기 때문에, 하나의 miRNA의 가능성이 수십 또는 수백 개의 대상, 그 반대에 바인딩 할 수 있습니다. 이러한 무차별 결합 특성이 극적으로 규제의 복잡성 수준뿐만 아니라 개인의 miRNAs의 기능을 결정 난이도와 역할 세포 기능 18-21에서 각 플레이를 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 연구의 miRNA는 DNA 메틸화 상태 (17)에 영향을 미치는로 분화시 유전자 발현을 정련하는 것으로 나타났습니다. RPE에 대한보다 구체적인 연구에서 miR-204/211은 RPE (22)의 상피 표현형을 촉진하기 위해 표시했다. 다른 그룹은 miRNA의 프로파일을 분석RPE의 ES 세포로부터 분화시와의 miRNA의 독특한 세트를 밝혔다는 분화 과정 23시 표현된다. 사실, miRNA의 프로파일은 명확 ES 세포, 전구 세포, 그리고 말단 분화 세포 24,25 포함한 세포 유형을 구분할 수있다. 250의 miRNAs는 망막로 표현된다. 이러한 연구에 기초하여, 우리의 miRNA가 IP의 망막 색소 상피의 분화 과정에 중요한 역할을한다는 가설을 세웠다. 이 보고서의 목적은 IMR90-4 IP의 RPE의 차별화를위한 프로토콜을 설명하는 것입니다 세포, 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs, iPS 세포를 식별하는 마이크로 어레이 데이터의 분석 , IPS-RPE 및 태아 RPE. 전체 RNA는 각 세포 유형의 배양으로부터 추출하고 1,205 인간의 miRNAs 144 바이러스의 miRNAs 특정 프로브를 함유하는 miRNA의 마이크로 어레이에 혼성화시켰다. 마이크로 어레이 결과를 비교 하​​였다의 miRNA가 차별적으로 다른 종류의 세포들로 표현 된 결정 D. 2 배 또는 식의 큰 배 변화의 miRNAs는 추가 분석을 위해 선택되었다. miRNA의 분석 소프트웨어 프로그램은 차등 발현 된 miRNAs의 잠재적 표적을 식별하고 선택의 miRNAs 의해 규제 셀룰러 네트워크를 생성하기 위해 사용되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

이 보고서의 목적은 마이크로 RNA (miRNA의) 인간 iPS 세포 (IPS-RPE)에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 태아 RPE의 프로파일을 비교하기위한 프로토콜을 설명하는 것입니다. 프로토콜은 마이크로 어레이로 분석 RNA의 수집 및 차동 세 종류의 세포 사이에 표현의 miRNAs를 확인하는 마이크로 어레이 데이터의 분석을 포함한다. iPS 세포와 태아의 망막 색소 상피의 문화에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 인간의 IPS에서 RPE의 차별화를 위해 사용되는 프로토콜은 설명한다. 우리가 설명 RNA 추출 기술은 miRNA의 마이크로 어레이에 사용하기위한 매우 작은 RNA의 최대 복구를 허용하도록 선택되었다. 마지막으로, 셀룰러 통로 및 마이크로 어레이 데이터의 네트워크 분석을 설명한다. 이러한 기술은 세 가지 서로 다른 유형의 세포의 miRNA 프로파일의 비교를 용이하게 할 것이다.

iPS 세포 (그림 1A)는 IPS-RPE 세포로 분화를 유도하는 분화 조건에서 성장했다. IPS-RPE는 육각형의 색소 세포 형태 태아 RPE (그림 1C)과 유사 (그림 1B)의 고전 RPE 표현형을 나타내었다. 나은의 miRNA는 IP의 IPS-RPE로 분화하는 과정 중에 재생할 수 역할을 이해하기 위해서는, miRNA의 발현 마이크로 어레이 분석을 실시 하였다. 총 RNA는 iPS 세포, 태아...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K 조회수.  JBSA Fort Sam Houston.  마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다. 

비디오: MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

연구

생물학

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

조직학적 분석을 위해 인간의 눈에서 망막 색소 상피/맥락막 플랫마운트의 효율적이고 일관된 생성

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). Since RPE are highly metabolically-active cells, alterations in their metabolic status reflect changes in their health and function. High-resolution respirometry allows for real-time kinetic analysis of the two major bioenergetic pathways, glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), through quantification of the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), respectively. The following is an optimized protocol for conducting high-resolution respirometry on primary human retinal pigment epithelial cells (H-RPE). This protocol provides a detailed description of the steps involved in producing bioenergetic profiles of RPE to define their basal and maximal OXPHOS and glycolytic capacities. Exposing H-RPE to different drug injections targeting the mitochondrial and glycolytic machinery results in defined bioenergetic profiles, from which key metabolic parameters can be calculated. This protocol highlights the enhanced response of BAM15 as an uncoupling agent compared to carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) to induce the maximal respiration capacity in RPE. This protocol can be utilized to study the bioenergetic status of RPE under different disease conditions and test the efficacy of novel drugs in restoring the basal metabolic status of RPE.

The metabolic status of human retinal pigment epithelial cells (H-RPE) reflects their health and function. Presented here is an optimized protocol for examining the real-time metabolic flux of H-RPE using high-resolution respirometry.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

망막 변성 모델링 및 분석

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

저자 스포트라이트: 연령 관련 황반변성의 발병기전 규명 및 잠재적 치료법 발견 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.