이 연구는 BrightFocus 재단 (DS)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

동물 주제와 관련 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그 대학에 의해 승인
1. 준비 솔루션
<ol><li>성장 매체에 의해 보충 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린/스, 2.5 m L-글루타민, m 및 1 x 메모리 불필요 한 아미노산이 포도 당을 준비 합니다. 미리 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 미디어 따뜻한.</li>
	<li>2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션을 준비:<ol>
<li>300 µ L HEPES 버퍼링 염 분 (50 mM HEPES/코 pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dispase II의 30 mg를 용 해 하 여 100mg/mL dispase II의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 볼륨은 3-4 마우스에 대 한, 그것은 최대 크기를 조정 하거나 아래 실험을 위해 쥐의 수에 따라 수). 이 주식은 4 ° c.에 적어도 1 주 동안 저장 될 수 있다</li>
		<li>살 균 DMEM, 높은 포도 당 및 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링의 1.2 mL dispase II 재고 100 mg/mL의 300 µ L을 추가 하 여 2 %dispase 작업 솔루션을 준비 합니다. 이 단계는 층 류 살 균 조건 하에서 캐비닛에서 수행 되어야 합니다. 미리 준비 된 dispase II 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 취득 마우스 눈
<ol><li>모든 승인 된 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 흡수 성 패드에 두십시오.</li>
	<li>장갑, 입고 엄지와 검지로 눈 주위 넣고 부드럽게 피부 proptose 안구에 밀어.</li>
	<li>피부와 안구 사이 각도 위 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 눈을 잘라. 오염을 방지 하려면 70% 에탄올에 눈을 찍어 잠시.</li>
	<li>즉시 눈에는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>2.2-2.4 두 번째 눈을 제거 하려면 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 눈 해 부
<ol><li>조심 스럽게 해 현미경 눈에서 결합 조직 제거. 이것은 건조 배양 접시 또는 PBS에 행 해질 수 있다.<ol>
<li>봉합 집게를 사용 하 여 안구에서 결합 조직 고 욕실이 위를 사용 하 여 밖으로 그들을 잘라. 그것은 거의 경우에 공 막 잘라 그대로 후부 eyecups를 얻을 수 있기 때문에 여 sclera를 자르지 않는다.</li>
		<li>결합 조직, 청소 후 다음 세척 단계에 대 한 PBS에 결과 눈알을 유지. 참고: 모든 다음 단계는 캐비닛 무 균 조건 하에서 층 류에서 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 두 번 눈을 씻으십시오. 신중 하 게 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 눈알 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 새로운 요리에 신선한 매체 매체 및 전송 눈알 발음</li>
	<li>DMEM (높은 혈당) 매체를 발음 하 고 37 ° C 배양 기에서 45 분을 위한 미리 데워 진된 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션에 눈을 품 어. 참고: 다음 단계에 놓고 눈 조직을 보호 하 고 해 부에 대 한 좋은 매체를 제공 하는 성장 매체에서 eyecups를 조작 합니다.</li>
	<li>Dispase II 솔루션을 제거 하 고 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 37 ° C에 미리 데워 진된 성장 매체 (그림 1a)를 추가 하 여 성장 매체에 두 번 눈을 씻고. 참고: dispase II에 의해 분리, 후 시선 될 부드러운.</li>
	<li>집게와 눈을 누른 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 욕실이 위를 사용 하 여 각 눈의 오 라 참나무 주위 절 개 합니다.<ol>
<li>솔루션에 안구 유지, 조심 스럽게 ora 참나무 둘레 컷을 확장 하 고 컷 완료 후 멀리 앞쪽 막 당기 앞쪽 각 막 제거.</li>
		<li>부드럽게 teethed 집게 (그림 1b, 1c)으로 아이피에서 그들을 당겨 렌즈 캡슐과 관련 된 홍 채 색소 상피를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 신경 망막의 분리를 촉진 하기 위하여 37 ° C에서 20 분에 대 한 성장 매체에 결과 후부 eyecups를 품 어.</li>
	<li>층 류 캐비닛 배치 해 현미경 4 꽃잎에 후부 eyecups 잘라. 인하 충분히 짧은 만큼 꽃잎을 연결 (그림 1의 d)를 유지 하지만 아이피를 평평 하 게 해야 합니다.<ol>
<li>아이피를 평평 하 게 하 고 나머지를 잡고 집게와 매우 부드럽게 당겨 신경 망막 분리 RPE 맥락 막 sclera 복합 다른 집게 (그림 1e). 가장자리에서 보다 중심에서 철수 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 메 마른 문화 접시에 4 등분된 모든 조직으로 가득 전송 사전 37 ° C 성장 매체를 따뜻하게 합니다.</li>
</ol>4입니다. 기본 RPE 세포의 고립
<ol><li>함께 4 등분 RPE 맥락 막 sclera 단지 보유 한 꽃잎 집게 슈퍼 파인, 부드럽게 해 현미경 microsurgical 초승달 모양의 칼을 사용 하 여 기본 지하실 막 (Bruch의 막)에서 RPE의 그대로 시트를 벗기다 층 류 캐비닛 (그림 1 층)에 배치.<ol>
<li>RPE 시트 P200 micropipette를 사용 하 여 성장 매체를 포함 하는 새로운 메 마른 문화 접시에 전송 합니다. RPE 시트를 전송할 때 여러 번 pipetting으로 성장 매체와 피 펫 팁을 젖은 조직 팁 내부 고정 하지 않도록. RPE 맥락 막에서 명확 하 게 구별할 수 있을 것입니다: RPE 보이는 더 갈색, 맥락 막 어두운 보이는 끈 적 하 고 무성 한 하는 동안.</li>
		<li>맥락 막14RPE 분리 효소 소화와 집게 없이 부드러운 분리 또는 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 번 사용 하 여 미리 데워 진된 37 ° C RPE 시트 세척 살 균 배양 접시에 성장 매체. 각 세척 단계 후 신중 하 게 다른 조직 파편 망막 또는 맥락 막 등을 피하는 동안 RPE 시트를 수집 합니다. 마지막 세척의 끝에 P200 micropipette RPE 시트를 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 참고: 저기 RPE 시트 원심을 필요 없다: 그들은 1 분 이내 중력에 의해 침전 물 것 이다.</li>
	<li>P200 micropipette를 사용 하 여 추가 성장 매체를 제거 합니다. 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 P200 micropipette를 사용 하 여 그들을 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 단일 세포 현 탁 액 이상적 이지만 또한 너무 많은 분쇄를 하지 마십시오, 그렇지 않으면 RPE 세포는 살아남을 수 없습니다. 좋습니다 매우 부드럽게 분쇄를 40-50 시간.</li>
</ol>5. RPE 세포 배양
<ol><li>문화 접시에 셀 접시<ol>
<li>RPE 세포의 다운스트림 응용 프로그램 그들의 극성의 유지 필요, 접시는 RPE 12 잘 배양 배지에서 미리 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 2 쥐에서 세포. 높은 밀도에서 셀 도금 경우 RPE 세포 6 각형 모양 및 착 색 등 원래 속성을 유지할 수 있기 때문에 원하는입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시를 이동 하거나 경작의 첫 번째 72 h에 대 한 성장 매체를 변경 마십시오. 3 일 후, 오래 된 매체를 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체 바꿉니다. 그 후 문화 매체를 매일 변경 합니다. 일단 RPE 세포 confluency, 2% 성장 매체에서 FBS를 줄일 수 있습니다. 참고: 셀 수 있는 분할 0.25 %trypsin 사용 하 여. 그러나, 분한 후 셀 그들의 6 각형 모양 및 다음 구절에 염색 잃을 수 있습니다. 우리는 셀 분할 하지 않는 것이 좋습니다 있지만 문화권의 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 기본 셀 무기한 passaged 수 없습니다: 그들은 해제 후 5-7 구절 차별화 하는 데 알려져 있다.</li>
</ol>

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</ol>

DS는 연구 바이엘 헬스케어, 독일 및 F. 호프만-라 로슈, 스위스에서 자금을 받았다. 나머지 작가 아니 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 작품은 방지 실명 (무제한 보조금 Wilmer 눈 연구소와 피츠버그 대학교) 연구에 의해 지원 됩니다.  이 작품도 안과, 피츠버그 대학에서에서 DS 시작 자금에 의해 지원 됩니다.

제시 상세한 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 1 주 후 confluency를 도달 6 각형 모양 및 2 주 후 착 색 등 주요 RPE 특성을 제시 하는 신뢰할 수 있는 설립을 수 있습니다. 얻은 RPE 세포 다양 한 비타민 A 대사9,10 의 포토 리셉터 외부 세그먼트 식 균 작용 및 이온 전송11, 상피 세포 극성2, lysosomal 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용?...

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 편광 된 상피 세포의 층 이다. RPE 세포의 기능과 RPE 단층의 무결성 비전에 대 한 중요 하다는 RPE 외부 혈액 망막 방 벽, 물과 망막 사이의 이온의 수송을 유지 등 여러 프로세스에서 중요 한 역할을 담당 하기 때문에 고 맥락 막, 빛 흡수, 산화 스트레스, retinoid 대사의 제어 및 대뇌1,2의 외부 세그먼트의 식 균 작용 으로부터 보호 유리 체를 혈액에서 통과에서 체계적으로 관리 하는 마약 방지의 장벽 기능 뿐 아니라, 눈 뒤쪽 RPE의 위치는 RPE 기능에서 vivo에서의 복잡성을 연구 하기 어려울. 따라서, 유연 하 고, 제어 환경3,4RPE 세포 연구 RPE 세포 배양의 설립에 대 한 중대 한 필요가 있다.
설립 RPE 세포 선의 수 존재, 및 셀; 저장의 간단 하 고 편리한 방법을 제공 그러나, passaged 세포 1 차 셀2,,34에 비해 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 그들은 종종 세포 형태학에 있는 변화에 의해 특징은. 예를 들어 기존 셀 라인의 셀 극성 표현 형의 손실 및 단단한 접속점4의 부분 실종 RPE 장벽 속성의 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 적합을 발견 했다. 극성 및 적절 한 셀에 셀 연결의 손실 뿐만 아니라 RPE 세포 선을 신속 하 게 성인 RPE5키 melanogenesis 효소의 부재로 인해 그들의 착 색을 잃게됩니다. 색소를 복원할 수 있습니다, 하지만 다시 염색 전송 전자 현미경 검사 법의 조합 포함의 메커니즘의 포괄적인 분석, 멜 라 닌의 존재를 확인 하 진 식 분석, 화학 분석 적 되어 수행된6. 한 가지 더 한계는 RPE 세포 라인 확장된 셀 생활 (때로는-불멸) 있고, 특정 조건에서 양식 식민지7, 부동 고 기판에서 분리 하는 자기 갱신 multipotent 줄기 세포로 변형 시킬 수 있다 8.이 제한 이식 실험3셀 라인 사용을 불가능 하 게.
설립된 RPE 세포 라인의 단점을 고려 하면 신선한 조직에서 얻은 기본 RPE 세포 배양 수는 RPE 공부를 좀 더 생물학적으로 관련 모델 역할을 합니다. 뿐만 아니라와 같은 비타민 A 대사9, 먹어서 포토 리셉터 외부 세그먼트10 이온의 수송11, RPE 특정 기능을 공부 뿐만 아니라와 같은 기본적인 세포 생물학 공부 기본 RPE 세포 사용 된 상피 세포 극성2 , lysosomal 항상성 그리고 autophagy12,13.
지난 몇 년간 수의 기본 RPE 문화에 게시 되었습니다, 연구3,,1415의이 지역에 있는 성장 관심사를 나타내는. 인간의 RPE 세포와 비 인간 RPE 세포 소 및 돼지 RPE 세포 등 수많은 프로토콜 했다 게시 된16,17,,1819. 그러나, 그들의 매우 더 작은 크기 때문에 마우스 RPE 세포를 처리 하기 위해 더 어렵습니다. 비록 꽤 간행물의 수는 마우스14,,2021에서 RPE 세포 격리 프로토콜, 지금도 많은 연구 없이 RPE 세포를 분리 하 고 투 맥락 막 셀 또는 셀 신경 망막에서의 오염. 여기 선물이 기본 마우스 RPE 세포 배양, 마우스, 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리에서 눈을 얻는 등을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 비디오 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 작업 필요 해 부 기법에 대 한 지침을 시작 하는 연구자에 대 한 특히 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 높은 편광된 다기능 상피가 이다. Hexagonally 포장 및 단단한 접속점에 의해 연결 된 색소 세포의 단일 시트입니다. RPE의 주요 기능은 시각적 사이클에 빛, 창 고 포토 리셉터 외부 세그먼트의 식 균 작용, 이온의 공간 버퍼링, 영양분, 이온 물 뿐만 아니라 적극적인 참여의 전송의 흡수를 포함 합니다. 이러한 중요 하 고 다양 한 기능, RPE 세포의 생물학 연구에 매우 중요입니다. RPE 세포 선의 수 설립 되었습니다; 그러나, passaged와 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 일부를 잃고 자연 RPE 세포의 형태학 적 및 생리 적 특성의 알려져 있습니다. 따라서 1 차 셀은 RPE 세포 생물학 및 기능의 다양 한 측면을 공부 하는 데 더 적합. 그러나 마우스 기본 RPE 세포 배양 연구원에 게 유용 이후 마우스 모델 생물학 연구에서 널리 이용 된다, 마우스에서 세포 수집 RPE는 또한 그들의 작은 크기 때문에 매우 도전. 여기, 선물이 enucleation 및 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리를 포함 하는 기본 마우스 RPE 세포 배양을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 메서드는 효율적인 셀 복구를 수 있습니다. 두 쥐에서 얻은 RPE 세포 문화와 디스플레이 일부 선의의 RPE의 원래 속성의 6 각형 모양 및 2 후 착 색 등 세포의 1 주 후 문화 접시에 사전 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 confluency를 도달할 수 있다 문화의 주.

마우스 기본 RPE 문화권 문화에 1 주 후 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95 %confluency 2 쥐에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료, 및 이중 nucleated 세포의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 문화, 모양 및 착 색, 형성 하기 위하여 계속 하는 세포의 3 주, 4 주 후 셀의 일부 있어 hyperpigmented (그림 2).
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Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

비디오: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

연구

신경과학

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

생물학

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

배양된 1차 쥐 RPE의 특성화 및 형태학적 역학

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

저자 스포트라이트: 망막병증 연구를 위한 성인 마우스의 원발성 망막 색소 상피 세포의 효율적인 분리

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

요약

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통가 경사진 마우스 망막의 장기, 세럼 없는 재배는 그대로 망막 색소 상피와 함께 익스처스

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리