이 연구는 BrightFocus 재단 (DS)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

동물 주제와 관련 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 피츠버그 대학에 의해 승인
1. 준비 솔루션
<ol><li>성장 매체에 의해 보충 Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린/스, 2.5 m L-글루타민, m 및 1 x 메모리 불필요 한 아미노산이 포도 당을 준비 합니다. 미리 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 미디어 따뜻한.</li>
	<li>2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션을 준비:<ol>
<li>300 µ L HEPES 버퍼링 염 분 (50 mM HEPES/코 pH 7.4, 150 mM NaCl)에 dispase II의 30 mg를 용 해 하 여 100mg/mL dispase II의 재고 솔루션을 준비 합니다. 이 볼륨은 3-4 마우스에 대 한, 그것은 최대 크기를 조정 하거나 아래 실험을 위해 쥐의 수에 따라 수). 이 주식은 4 ° c.에 적어도 1 주 동안 저장 될 수 있다</li>
		<li>살 균 DMEM, 높은 포도 당 및 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링의 1.2 mL dispase II 재고 100 mg/mL의 300 µ L을 추가 하 여 2 %dispase 작업 솔루션을 준비 합니다. 이 단계는 층 류 살 균 조건 하에서 캐비닛에서 수행 되어야 합니다. 미리 준비 된 dispase II 사용 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 취득 마우스 눈
<ol><li>모든 승인 된 방법을 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 흡수 성 패드에 두십시오.</li>
	<li>장갑, 입고 엄지와 검지로 눈 주위 넣고 부드럽게 피부 proptose 안구에 밀어.</li>
	<li>피부와 안구 사이 각도 위 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 눈을 잘라. 오염을 방지 하려면 70% 에탄올에 눈을 찍어 잠시.</li>
	<li>즉시 눈에는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 페 트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>2.2-2.4 두 번째 눈을 제거 하려면 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>3. 눈 해 부
<ol><li>조심 스럽게 해 현미경 눈에서 결합 조직 제거. 이것은 건조 배양 접시 또는 PBS에 행 해질 수 있다.<ol>
<li>봉합 집게를 사용 하 여 안구에서 결합 조직 고 욕실이 위를 사용 하 여 밖으로 그들을 잘라. 그것은 거의 경우에 공 막 잘라 그대로 후부 eyecups를 얻을 수 있기 때문에 여 sclera를 자르지 않는다.</li>
		<li>결합 조직, 청소 후 다음 세척 단계에 대 한 PBS에 결과 눈알을 유지. 참고: 모든 다음 단계는 캐비닛 무 균 조건 하에서 층 류에서 수행 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 두 번 눈을 씻으십시오. 신중 하 게 미리 데워 진된 37 ° C DMEM (높은 혈당)에 눈알 집게를 사용 하 여 전송 합니다. 새로운 요리에 신선한 매체 매체 및 전송 눈알 발음</li>
	<li>DMEM (높은 혈당) 매체를 발음 하 고 37 ° C 배양 기에서 45 분을 위한 미리 데워 진된 2% (wt/vol) dispase II 작업 솔루션에 눈을 품 어. 참고: 다음 단계에 놓고 눈 조직을 보호 하 고 해 부에 대 한 좋은 매체를 제공 하는 성장 매체에서 eyecups를 조작 합니다.</li>
	<li>Dispase II 솔루션을 제거 하 고 오래 된 매체를 발음 하 고 새로운 37 ° C에 미리 데워 진된 성장 매체 (그림 1a)를 추가 하 여 성장 매체에 두 번 눈을 씻고. 참고: dispase II에 의해 분리, 후 시선 될 부드러운.</li>
	<li>집게와 눈을 누른 층 류 캐비닛 배치 해 현미경 욕실이 위를 사용 하 여 각 눈의 오 라 참나무 주위 절 개 합니다.<ol>
<li>솔루션에 안구 유지, 조심 스럽게 ora 참나무 둘레 컷을 확장 하 고 컷 완료 후 멀리 앞쪽 막 당기 앞쪽 각 막 제거.</li>
		<li>부드럽게 teethed 집게 (그림 1b, 1c)으로 아이피에서 그들을 당겨 렌즈 캡슐과 관련 된 홍 채 색소 상피를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 신경 망막의 분리를 촉진 하기 위하여 37 ° C에서 20 분에 대 한 성장 매체에 결과 후부 eyecups를 품 어.</li>
	<li>층 류 캐비닛 배치 해 현미경 4 꽃잎에 후부 eyecups 잘라. 인하 충분히 짧은 만큼 꽃잎을 연결 (그림 1의 d)를 유지 하지만 아이피를 평평 하 게 해야 합니다.<ol>
<li>아이피를 평평 하 게 하 고 나머지를 잡고 집게와 매우 부드럽게 당겨 신경 망막 분리 RPE 맥락 막 sclera 복합 다른 집게 (그림 1e). 가장자리에서 보다 중심에서 철수 시작.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새로운 메 마른 문화 접시에 4 등분된 모든 조직으로 가득 전송 사전 37 ° C 성장 매체를 따뜻하게 합니다.</li>
</ol>4입니다. 기본 RPE 세포의 고립
<ol><li>함께 4 등분 RPE 맥락 막 sclera 단지 보유 한 꽃잎 집게 슈퍼 파인, 부드럽게 해 현미경 microsurgical 초승달 모양의 칼을 사용 하 여 기본 지하실 막 (Bruch의 막)에서 RPE의 그대로 시트를 벗기다 층 류 캐비닛 (그림 1 층)에 배치.<ol>
<li>RPE 시트 P200 micropipette를 사용 하 여 성장 매체를 포함 하는 새로운 메 마른 문화 접시에 전송 합니다. RPE 시트를 전송할 때 여러 번 pipetting으로 성장 매체와 피 펫 팁을 젖은 조직 팁 내부 고정 하지 않도록. RPE 맥락 막에서 명확 하 게 구별할 수 있을 것입니다: RPE 보이는 더 갈색, 맥락 막 어두운 보이는 끈 적 하 고 무성 한 하는 동안.</li>
		<li>맥락 막14RPE 분리 효소 소화와 집게 없이 부드러운 분리 또는 사용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 번 사용 하 여 미리 데워 진된 37 ° C RPE 시트 세척 살 균 배양 접시에 성장 매체. 각 세척 단계 후 신중 하 게 다른 조직 파편 망막 또는 맥락 막 등을 피하는 동안 RPE 시트를 수집 합니다. 마지막 세척의 끝에 P200 micropipette RPE 시트를 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 참고: 저기 RPE 시트 원심을 필요 없다: 그들은 1 분 이내 중력에 의해 침전 물 것 이다.</li>
	<li>P200 micropipette를 사용 하 여 추가 성장 매체를 제거 합니다. 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체에 셀 resuspend 그리고 부드럽게 P200 micropipette를 사용 하 여 그들을 triturate. 거품의 형성을 하지 마십시오. 단일 세포 현 탁 액 이상적 이지만 또한 너무 많은 분쇄를 하지 마십시오, 그렇지 않으면 RPE 세포는 살아남을 수 없습니다. 좋습니다 매우 부드럽게 분쇄를 40-50 시간.</li>
</ol>5. RPE 세포 배양
<ol><li>문화 접시에 셀 접시<ol>
<li>RPE 세포의 다운스트림 응용 프로그램 그들의 극성의 유지 필요, 접시는 RPE 12 잘 배양 배지에서 미리 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입 2 쥐에서 세포. 높은 밀도에서 셀 도금 경우 RPE 세포 6 각형 모양 및 착 색 등 원래 속성을 유지할 수 있기 때문에 원하는입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시를 이동 하거나 경작의 첫 번째 72 h에 대 한 성장 매체를 변경 마십시오. 3 일 후, 오래 된 매체를 신선한 미리 따뜻하게 성장 매체 바꿉니다. 그 후 문화 매체를 매일 변경 합니다. 일단 RPE 세포 confluency, 2% 성장 매체에서 FBS를 줄일 수 있습니다. 참고: 셀 수 있는 분할 0.25 %trypsin 사용 하 여. 그러나, 분한 후 셀 그들의 6 각형 모양 및 다음 구절에 염색 잃을 수 있습니다. 우리는 셀 분할 하지 않는 것이 좋습니다 있지만 문화권의 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 기본 셀 무기한 passaged 수 없습니다: 그들은 해제 후 5-7 구절 차별화 하는 데 알려져 있다.</li>
</ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

DS는 연구 바이엘 헬스케어, 독일 및 F. 호프만-라 로슈, 스위스에서 자금을 받았다. 나머지 작가 아니 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 이 작품은 방지 실명 (무제한 보조금 Wilmer 눈 연구소와 피츠버그 대학교) 연구에 의해 지원 됩니다.  이 작품도 안과, 피츠버그 대학에서에서 DS 시작 자금에 의해 지원 됩니다.

제시 상세한 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 1 주 후 confluency를 도달 6 각형 모양 및 2 주 후 착 색 등 주요 RPE 특성을 제시 하는 신뢰할 수 있는 설립을 수 있습니다. 얻은 RPE 세포 다양 한 비타민 A 대사9,10 의 포토 리셉터 외부 세그먼트 식 균 작용 및 이온 전송11, 상피 세포 극성2, lysosomal 같은 다운스트림 응용 프로그램에 사용?...

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 편광 된 상피 세포의 층 이다. RPE 세포의 기능과 RPE 단층의 무결성 비전에 대 한 중요 하다는 RPE 외부 혈액 망막 방 벽, 물과 망막 사이의 이온의 수송을 유지 등 여러 프로세스에서 중요 한 역할을 담당 하기 때문에 고 맥락 막, 빛 흡수, 산화 스트레스, retinoid 대사의 제어 및 대뇌1,2의 외부 세그먼트의 식 균 작용 으로부터 보호 유리 체를 혈액에서 통과에서 체계적으로 관리 하는 마약 방지의 장벽 기능 뿐 아니라, 눈 뒤쪽 RPE의 위치는 RPE 기능에서 vivo에서의 복잡성을 연구 하기 어려울. 따라서, 유연 하 고, 제어 환경3,4RPE 세포 연구 RPE 세포 배양의 설립에 대 한 중대 한 필요가 있다.
설립 RPE 세포 선의 수 존재, 및 셀; 저장의 간단 하 고 편리한 방법을 제공 그러나, passaged 세포 1 차 셀2,,34에 비해 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 그들은 종종 세포 형태학에 있는 변화에 의해 특징은. 예를 들어 기존 셀 라인의 셀 극성 표현 형의 손실 및 단단한 접속점4의 부분 실종 RPE 장벽 속성의 신뢰할 수 있는 연구에 대 한 적합을 발견 했다. 극성 및 적절 한 셀에 셀 연결의 손실 뿐만 아니라 RPE 세포 선을 신속 하 게 성인 RPE5키 melanogenesis 효소의 부재로 인해 그들의 착 색을 잃게됩니다. 색소를 복원할 수 있습니다, 하지만 다시 염색 전송 전자 현미경 검사 법의 조합 포함의 메커니즘의 포괄적인 분석, 멜 라 닌의 존재를 확인 하 진 식 분석, 화학 분석 적 되어 수행된6. 한 가지 더 한계는 RPE 세포 라인 확장된 셀 생활 (때로는-불멸) 있고, 특정 조건에서 양식 식민지7, 부동 고 기판에서 분리 하는 자기 갱신 multipotent 줄기 세포로 변형 시킬 수 있다 8.이 제한 이식 실험3셀 라인 사용을 불가능 하 게.
설립된 RPE 세포 라인의 단점을 고려 하면 신선한 조직에서 얻은 기본 RPE 세포 배양 수는 RPE 공부를 좀 더 생물학적으로 관련 모델 역할을 합니다. 뿐만 아니라와 같은 비타민 A 대사9, 먹어서 포토 리셉터 외부 세그먼트10 이온의 수송11, RPE 특정 기능을 공부 뿐만 아니라와 같은 기본적인 세포 생물학 공부 기본 RPE 세포 사용 된 상피 세포 극성2 , lysosomal 항상성 그리고 autophagy12,13.
지난 몇 년간 수의 기본 RPE 문화에 게시 되었습니다, 연구3,,1415의이 지역에 있는 성장 관심사를 나타내는. 인간의 RPE 세포와 비 인간 RPE 세포 소 및 돼지 RPE 세포 등 수많은 프로토콜 했다 게시 된16,17,,1819. 그러나, 그들의 매우 더 작은 크기 때문에 마우스 RPE 세포를 처리 하기 위해 더 어렵습니다. 비록 꽤 간행물의 수는 마우스14,,2021에서 RPE 세포 격리 프로토콜, 지금도 많은 연구 없이 RPE 세포를 분리 하 고 투 맥락 막 셀 또는 셀 신경 망막에서의 오염. 여기 선물이 기본 마우스 RPE 세포 배양, 마우스, 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리에서 눈을 얻는 등을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 비디오 프로토콜 마우스 기본 RPE 문화 작업 필요 해 부 기법에 대 한 지침을 시작 하는 연구자에 대 한 특히 유용할 것 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">animals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:388px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">2~3-week old wildtype mice</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">reagents</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dispase II</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Cellgro</td>
			<td style="width:123px;">61-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">KOH</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM9759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethyl Alcohol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">RPE65 antibody</td>
			<td style="width:123px;">A gift from Dr. Michael Redmond</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescein Phalloidin&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">F432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">A11011&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Polysciences, Inc</td>
			<td style="width:123px;">00380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:38px;width:347px;">ZO-1 Polyclonal Antibody</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Name</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">instruments and equipments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:347px;">Laminar flow cabinet</td>
			<td style="width:123px;">Baker</td>
			<td style="width:123px;">SterilGARD SG403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">CO2 incubator with hot air sterilization</td>
			<td style="width:123px;">Binder</td>
			<td style="width:123px;">C150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td style="width:123px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:123px;">COR-3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td>
			<td style="width:123px;">STEPHENS instruments</td>
			<td style="width:123px;">S7-1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td>
			<td style="width:123px;">Stroz Ophthalmic Instruments</td>
			<td style="width:123px;">E1796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Crescent straight knife</td>
			<td style="width:123px;">Beaver-Visitec International</td>
			<td style="width:123px;">373808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:347px;">Vannas Scissors, 8 cm, 45&#176; Angle, Standard</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">500260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">SLGL0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Syringe, 5 mL</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Inverted Laboratory Microscope&#160;Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Leica&#160;</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette</td>
			<td style="width:123px;">Gilson</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Barrier and non-filtered pipette tips</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

망막 안료 상피 (RPE) 신경 망막을 눈의 맥락 막 사이 있는 높은 편광된 다기능 상피가 이다. Hexagonally 포장 및 단단한 접속점에 의해 연결 된 색소 세포의 단일 시트입니다. RPE의 주요 기능은 시각적 사이클에 빛, 창 고 포토 리셉터 외부 세그먼트의 식 균 작용, 이온의 공간 버퍼링, 영양분, 이온 물 뿐만 아니라 적극적인 참여의 전송의 흡수를 포함 합니다. 이러한 중요 하 고 다양 한 기능, RPE 세포의 생물학 연구에 매우 중요입니다. RPE 세포 선의 수 설립 되었습니다; 그러나, passaged와 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 일부를 잃고 자연 RPE 세포의 형태학 적 및 생리 적 특성의 알려져 있습니다. 따라서 1 차 셀은 RPE 세포 생물학 및 기능의 다양 한 측면을 공부 하는 데 더 적합. 그러나 마우스 기본 RPE 세포 배양 연구원에 게 유용 이후 마우스 모델 생물학 연구에서 널리 이용 된다, 마우스에서 세포 수집 RPE는 또한 그들의 작은 크기 때문에 매우 도전. 여기, 선물이 enucleation 및 눈의 해 부 및 세포 배양에 대 한 항복 RPE 시트의 격리를 포함 하는 기본 마우스 RPE 세포 배양을 설정 하기 위한 프로토콜. 이 메서드는 효율적인 셀 복구를 수 있습니다. 두 쥐에서 얻은 RPE 세포 문화와 디스플레이 일부 선의의 RPE의 원래 속성의 6 각형 모양 및 2 후 착 색 등 세포의 1 주 후 문화 접시에 사전 로드 한 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 confluency를 도달할 수 있다 문화의 주.

마우스 기본 RPE 문화권 문화에 1 주 후 12 m m 폴 리 에스테 르 막 삽입에 도달 90-95 %confluency 2 쥐에서 설립. 2 주 후 문화, 셀 100 %confluency 도달 하 고 6 각형, 안료, 및 이중 nucleated 세포의 모자이크를 형성 하기 시작 했다. 문화, 모양 및 착 색, 형성 하기 위하여 계속 하는 세포의 3 주, 4 주 후 셀의 일부 있어 hyperpigmented (그림 2).
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Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

마우스 망막 안료 상피에서 1 차 셀 문화

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine. 망막 안료 상피 (RPE)은 눈의 다기능 상피가 이다. 여기 선물이 murine RPE에서 파생 하는 기본 세포 배양을 설정 하는 프로토콜.

비디오: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

연구

생물학

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

니트로환원효소/메트로니다졸 매개 절제 및 제브라피쉬 망막 색소 상피의 재생 연구를 위한 MATLAB 플랫폼(RpEGEN)

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

돼지 망막 색소 상피 세포의 1 차 배양

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...