이 방법은 전체 인간 망막에서 RP 세포의 표현형 차이를 이해하는 데 도움이됩니다. Davide Ortolan이 개발 한 해부 기술은 RP와 망막 사이의 분리를 생성하는 데 매우 재현 가능합니다. 그리고 REShAPE 소프트웨어는 RP 플랫 마운트의 큰 이미지를 분석하는 데 정말 유용합니다.
Davide가 개발 한 방법은 다양한 유형의 망막 퇴행성 질환 환자로부터 RP 표현형의 지역적 차이를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 50 밀리리터 원추형 튜브를 5 밀리리터 표시 아래로 약간 자릅니다. 뜨거운 접착제를 사용하여 튜브 팁을 계량 보트의 바닥에 부착합니다.
그런 다음 실리콘 엘라스토머 키트의 두 구성 요소를 10:1 비율로 혼합하여 공기가 끼지 않도록 합니다. 혼합물을 둥근 바닥 튜브의 이 구형 조각이 들어 있는 계량 보트에 붓습니다. 실리콘을 실온에서 밤새 경화시킵니다.
경화된 실리콘 몰드에서 계량 보트와 둥근 바닥 튜브를 제거합니다. 먼저 1 밀리리터 주사기에 1700 밀리몰의 D- 만니톨 용액을 채우고 21 게이지 바늘에 부착하십시오. 눈의 전방에 구멍이 뚫리지 않도록 파스 플라나를 통해 바늘을 삽입하고 400 마이크로 리터의 용액을 유리체에 주입합니다.
눈을 실온에서 45 분 동안 그대로 두십시오. 한 쌍의 미세한 가위와 집게를 사용하여 파 플라나 수준에서 전방을 자릅니다. 칼슘과 마그네슘을 함유 한 DPBS로 후방 안구를 채 웁니다.
실체 현미경으로 망막의 노란색 점으로 시각화 된 황반을 국소화하십시오. 눈을 사분면, 즉 비강, 측두엽, 상급 및 하반으로 자르고 황반 부위를 보존하십시오. 방해가 되는 경우 바늘을 제거하십시오.
나비를 눈의 후방으로 옮겨 칼슘과 마그네슘이 함유 된 DPBS가 들어있는 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 망막을 제거하기 전에 모양체 가장자리에 V 자 모양의 컷을 만들어 황반이 들어있는 꽃잎을 표시하십시오. 망막에있는 모든 유리체를 들어 올리고 자릅니다.
RPE가 긁히지 않도록 모든 꽃잎의 섬모 가장자리에서 망막을 자릅니다. 조직을 4%PFA에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 칼슘과 마그네슘이 함유 된 DPBS로 3 회 세척하십시오.
조직을 동일한 완충액으로 채워진 용기에 옮기고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음으로, 칼슘과 마그네슘이 함유 된 DPBS가 들어있는 100mm 페트리 접시에 샘플을 옮깁니다. 1.5mm 생검 펀치로 시신경 머리를 펀치하십시오.
망막을 모아서 섭씨 4도에서 동일한 완충액에 보관하십시오. RPE 맥락막에서 공막을 제거하려면 주변에서 RPE 맥락막 층을 부드럽게 들어 올립니다. 그런 다음 Vannas 봄 가위로 공막과 RPE 사이에있는 맥락막과 결합 조직을 자릅니다.
공막에서 완전히 분리 된 후 RPE 맥락막 층을 수집하십시오. 조직을 칼슘과 마그네슘이 들어있는 DPBS로 채워진 용기에 옮기고 섭씨 4도에서 보관하십시오. RPE 맥락막을 6웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.
샘플을 차단하고 실온에서 1시간 동안 투과화한다. 샘플을 투과화 완충액에서 1 내지 250 희석으로 647 형광단과 접합된 팔로이딘과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 칼슘과 마그네슘이 함유 된 DPBS에서 3 번 씻으십시오.
RPE 맥락막 샘플을 50 x 75mm 유리 슬라이드로 옮기고 평평하게 만듭니다. 샘플을 더 평평하게 만들기 위해 각 꽃잎을 두 개로 자릅니다. 소수성 펜으로 플랫 마운트의 윤곽을 그립니다.
리포푸신 자가형광을 담금질하려면 500마이크로리터의 자가형광 소광제 용액을 추가하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS로 철저히 씻으십시오. DPBS를 제거하고 장착 매체를 추가합니다.
평평한 마운트에 커버 유리를 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 소프트웨어를 엽니다. 디렉터리 탭에서 입력 및 출력 폴더를 선택합니다.
출력 디렉토리에서 소프트웨어가 입력 디렉토리 또는 프로세스의 경로를 자동으로 변경하도록 합니다. 또는 출력 디렉터리를 수동으로 변경합니다. 히트 맵을 생성하려면 컬러 이미지 만들기 탭의 드롭다운 메뉴에서 모두를 선택합니다.
수동 제한 사용 기능에서 아니오 확인란을 선택하여 소프트웨어가 각 이미지에서 감지된 최소값과 최대값을 사용할 수 있도록 합니다. yes 확인란을 선택하여 각 셰이프 메트릭 히트 맵의 값 범위를 수동으로 조정합니다. 그런 다음 제한 설정 버튼을 클릭하고 텍스트 상자에 값을 삽입하여 개별 매개 변수의 범위를 선택하십시오.
관심있는 값을 변경 한 후 저장을 클릭하십시오. 낮은 기본값을 클릭하여 모든 제한을 재설정합니다. 더 낮은 셀 크기에서 셀 크기 임계값을 선택하려면 분석에 포함할 가장 작은 셀의 크기를 삽입합니다.
상위 셀 크기에 포함할 가장 큰 셀의 크기를 삽입합니다. 픽셀을 실제 단위로 변환에서 픽셀 단위로 분석을 실행하려면 아니오를 선택하고 마이크로미터 단위로 분석을 실행하려면 예를 선택합니다. 축척 막대 픽셀의 길이에서 텍스트 상자에 픽셀 값을 입력합니다.
스케일 바 미크론의 길이에 해당 거리를 마이크로미터 단위로 입력합니다. 분석을 시작하려면 이동을 누릅니다. 이 프로토콜은 RPE 셀 경계의 REShAPE 생성 분할로 셀 위치가 식별되는 플랫 마운트의 단일 평면 이미지를 생성합니다.
또한 올바르게 식별된 모든 RPE 셀에 대해 개별 RPE 셀의 셀 면적을 포함한 30개의 형상 메트릭이 측정됩니다. 망막의 잔여 조각이나 다른 밝은 물체로 인한 검은색 타일은 RT 필터 드롭다운 메뉴에서 사용할 수 있는 필터링 옵션 중 하나를 선택하여 제거할 수 있습니다. 모양 변경 분석에 RBG 이미지를 사용하면 완전히 검은색 이진 이미지가 생성됩니다.
이 경우 RGB 이미지를 그레이 스케일로 변환하면 올바르게 분할된 이진 이미지가 생성됩니다. 염색이 최적이 아니거나 샘플이 스크래치에 의해 손상된 경우 큰 세포 덩어리가 하나의 매우 큰 세포로 식별될 수 있습니다. 이 경우 큰 객체는 셀 크기 임계값을 변경하여 분석에서 제외할 수 있습니다.
평평한 조직을 얻으려면 RP와 맥락막이 이러한 단계에 오랜 시간이 걸릴 수 있더라도 공막에서 분리되어야 합니다. RP 플랫 마운트 생성 후 RP 단층의 다른 영역을 연구할 수 있도록 추가 RPE 마커를 염색할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 서로 다른 망막 퇴행성 질환에 차별적으로 민감한 5 개의 서로 다른 RP 집단을 발견했습니다.
