ROMA는 질병을 유발하는 CFTR 돌연변이가 2개 미만이고 땀불소가 중간일 때 낭포성 섬유증이 있는 피험자와 없는 피험자의 오가노이드를 구별할 수 있습니다. ROMA는 모든 연령대에서 낮은 합병증 발생률로 수행 할 수 있습니다. 분석은 반자동화되고 표준화되며 생검은 분석을 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있습니다.
ROMA에 사용되는 오가노이드는 CFTR 조절 효능에 접근하는 데에도 사용할 수 있으며 ROMA는 CFTR 기능의 회복 정도를 측정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 도금 후 하루 만에 오가노이드를 칼슘 그린으로 염색하십시오. 뚜껑을 덮은 상태에서 플레이트를 몇 번 회전시키고 약간 기울여 전체 우물에서 칼슘 그린의 균일 한 분포를 보장합니다.
웰의 모든 유기체가 염색되도록 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 15-30분 동안 플레이트를 다시 배양합니다. 오가노이드에 초점을 맞추려면 최적의 X 및 Y 위치를 결정하고 컨포칼 현미경을 사용하여 각 웰의 오가노이드에 수동으로 초점을 맞춥니다. 그리고 이러한 위치를 이미징 소프트웨어에 저장합니다.
다음으로, 라이브 셀 이미징 설정을 사용하여 방출을 488나노미터로, 여기를 515나노미터로, LD 배율 대물렌즈를 5X로 설정합니다. 오가노이드 사진을 획득하려면 컨포칼 현미경을 사용하여 1024 x 1024 픽셀의 해상도와 16 비트 깊이의 단위 방향 방식으로 이미지를 촬영하십시오. 낭포성 섬유증과 비낭포성 섬유증 오가노이드 간의 형태학적 차이를 최적으로 시각화하기 위해 레이저 강도와 마스터 게인을 선택하십시오.
실험을 시작하여 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 현미경 형식으로 32개 웰 모두에 대해 웰당 하나의 사진을 저장하고 TIFF 파일로 내보냅니다. 먼저 이미지 분석 소프트웨어에서 TIFF 파일을 로드한 다음 운영자가 결정한 제외 기준에 따라 첫 번째 품질 검사를 수행합니다.
도금 밀도가 부적절할 때, 오가노이드가 너무 많거나 너무 적은 경우, 형광 분포가 부적절한 경우 많은 분화되거나 죽은 구조 또는 파편이 존재하는 경우 사진 세트를 제외합니다. 분석할 영상을 준비하려면 각 오가노이드 배양에 대해 32개 그림 모두의 네트워크 데이터 파일 하나를 만들고 열어 대상당 32개 그림을 모두 동시에 분석할 수 있습니다. 그리고 하나의 픽셀이 2.5 x 2.5 마이크로미터에 해당하도록 이미지를 재보정합니다.
그런 다음 강도 하한 임계 값 4, 500과 상한 임계 값 65, 535를 사용하여 구조를 묘사하고 부드럽고 깨끗한 기능을 끄고 채우기 구멍 기능을 켜고 별도의 기능을 3X로 설정합니다. 유기체를 계산하려면 40 마이크로 미터 이상의 모든 구조를 선택하십시오. 다음으로 ND 측정 업데이트 버튼을 클릭하면 계수된 오가노이드에 번호가 매겨집니다.
계산을 위해 강도와 원형도를 측정하려면 60마이크로미터 이상의 모든 구조를 선택하고 계산하십시오. 그런 다음 그림의 경계에 닿는 모든 구조를 제거하십시오. 다음으로, 각각의 경계로부터 1 픽셀을 침식하고, 60 마이크로미터 이상 또는 그 이상이고, 각 구조의 평균 강도를 측정한다.
그런 다음 60마이크로미터 이상의 모든 구조를 다시 선택하고 각 구조의 경계에서 10픽셀, 60마이크로미터 이상 또는 같은 구조를 침식합니다. 그런 다음 침식된 각 구조의 평균 강도와 각 구조의 원형도를 측정합니다. 그런 다음, 강도 측정 후 강도 측정 후 각각의 경계로부터 25 마이크로미터 이상, 60 마이크로미터 이상 또는 각각의 경계로부터 2.5 마이크로미터 침식 후의 강도 측정의 평균으로 나누어 강도비를 계산하고, 60 마이크로미터 이상 또는 같게 한다.
원고에 설명된 대로 소프트웨어에 의해 결정된 제외 기준에 따라 두 번째 품질 검사를 수행합니다. 212명의 피험자로부터 오가노이드를 수집하고 이미지화했습니다. 23 세트의 사진을 제외하고 낭포 성 섬유증과 CFTR 돌연변이를 일으키는 2 가지 질병을 가진 167 명의 피험자 및 22 명의 비 낭포 성 섬유증 피험자로부터의 오가노이드 사진을 분석 한 결과, 배양 당 평균 오가노이드 수는 1, 519 인 것으로 나타났다.
강도 비율과 원형도 지수는 낭포성 섬유증이 있거나 없는 피험자의 오가노이드에 대해 결정되었습니다. 이 두 지수를 사용하여 낭포성 섬유증이 있는 피험자와 없는 피험자의 오가노이드 간에 32개 웰 모두의 데이터를 사용할 때뿐만 아니라 각 배양에 대해 무작위로 8개의 웰을 선택했을 때 완벽한 구별을 얻었습니다. 4 개의 예시적인 배양에 대한 히스토그램을 얻었으며, 원형도에 대한 값의 분포, 오가노이드의 중앙 부분의 강도 및 전체 오가노이드의 강도를 보여줍니다.
강도비와 원형도 지수를 정확하게 계산하려면 고품질 사진이 필요하기 때문에 품질 관리가 필수적입니다. ROMA를 위해 확립된 오가노이드 배양물은 CFTR 치료의 효과를 테스트하기 위한 물리학 보조에도 사용될 수 있습니다. RNA, DNA 및 단백질은 CFTR 변이체의 추가 특성 분석을 위해 추출할 수 있습니다.
