낭포성 섬유증 환자에 대한 개별화된 요법은 기준선에서 CFTR 활성을 이해하기 위해 시험관내 질환 모델에 의해 달성될 수 있다. 인간 비강 상피 오가노이드 또는 HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하여 CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 여기에서는 이러한 HNE 오가노이드를 배양하고 이미징하는 방법론을 자세히 설명했습니다.
기능장애성 상피 이온 수송, 특히 염화물 및 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피 감소를 초래한다. 이것은 또한 점액 분비물에 영향을 미치며 점액 분비물과 폐색으로 이어집니다. 따라서 HNE 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용 분야를 위해 개발되었습니다.
기준선에서 또는 치료제에 대한 반응으로 CFTR 활성을 평가하는 것 외에도,이 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 포함하는 다른 질병에도 적용될 수 있습니다. 이러한 방법은 주로 낭포성 섬유증 연구에 사용하기 위해 개발되었습니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은기도 상피를 평가하는 다른 연구에서도 이러한 방법이 도움이 될 수 있습니다.
이러한 기술은 세부 사항과 정밀도에주의를 기울여야합니다. 그들은 또한 세포의 초기 확장이 적절한지 확인하기 위해주의 깊은 관찰이 필요합니다. 매일 모든 문화를 모니터링하면 성공할 가능성이 더 큽니다.
시작하려면 비강 브러시 생검을 15 밀리리터 원뿔형 튜브의 8 밀리터의 RPMI 배지로 해리시켜 세포학 브러시를 1 밀리리터의 대형 보어 피펫 팁을 통해 여러 번 통과시킵니다. 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 g에서 원심분리한다. 상청액을 버리고, 이어서 세포 펠릿을 세 밀리리터의 세포 분리 용액에 재현탁시킨다.
소화시키기 위해 실온에서 16분 동안 인큐베이션한다. 다섯 밀리리터의 팽창 배지를 사용하여 세포를 두 번 세척하십시오. 그런 다음, 이들을 T75 플라스크에 첨가하고, 조사, 불활성화 및 50 내지 60% 합류성 3T3 섬유아세포로 미리 시딩한다.
세포를 공동 배양하고 7 내지 14일 동안 팽창 배지에서 팽창시키도록 허용한다. 낭포성 섬유증 환자로부터 유래된 세포에 항생제를 도입한 경우, 배지는 배양 초기 사흘 후에 항생제가 없는 확장 배지로 교체되어야 하며, 80%가 합류할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 바꿀 수 있다. 세포를 1x DPBS로 세척하십시오.
이어서, 1.5 밀리리터의 0.05%트립신-EDTA를 T75 플라스크에 첨가하고, 섭씨 37도에서 4분 동안 인큐베이션하여 조사되고 불활성화된 3T3 섬유아세포를 배양물로부터 제거하였다. T75 플라스크를 1x DPBS로 두 번 헹구어 나머지 3T3 섬유아세포를 완전히 씻어냅니다. 1.5밀리리터의 0.05%트립신-EDTA를 T75 플라스크에 넣고 섭씨 37도에서 10분간 배양하여 HNE를 분리한다.
트립신을 대두 트립신 억제제로 일대일 비율로 중화시킨다. 세포를 5분 동안 500배 gi에서 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리고 세포를 다섯 밀리리터의 팽창 배지로 한 번 세척하십시오.
세포는 이제 오가노이드를 성장시키기 위해 시딩할 준비가 되었습니다. 오가노이드 배양물을 세포외 매트릭스 또는 ECM을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 15-웰 혈관신생 슬라이드를 동일한 온도에서 하룻밤 동안 식힌다.
다음으로 피펫 팁을 섭씨 네 도까지 식히십시오. 얼음 위에 다섯 마이크로 리터의 차가운 100 % ECM으로 슬라이드를 코팅하십시오. 이들을 통합을 위해 적어도 30분 동안 섭씨 37도에서 세포 배양 배양기에 넣는다.
혈구세포계를 사용하여 공동 배양물로부터 수확된 HNEs를 계수한다. 이어서, 세포를 총 수에서 마이크로리터 당 500개의 세포로 희석하고, 얼음 상에서 분화 배지에 의해 희석된 20%ECM으로 희석한다. ECM 코팅된 슬라이드를 인큐베이터에서 꺼내어 차가운 세포 ECM 혼합물 다섯 마이크로리터를 각각의 웰에 시드한다.
슬라이드를 즉시 섭씨 37도에서 배양 배양기로 한 시간 동안 옮기고 세포 ECM 혼합물을 통합시킨다. 그 후, 슬라이드를 인큐베이터 밖으로 꺼내어 50 마이크로리터의 분화 배지로 15-웰 혈관신생 슬라이드의 각 웰에 세포를 공급한다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 배양 배양기로 되돌려 놓고, 오가노이드가 추가 실험을 위해 준비될 때까지 격일로 배지를 바꿉니다.
8웰 유리 바닥 챔버 슬라이드를 셀 접착제로 30분 동안 전처리하십시오. 용액을 버리고 웰을 30 분 동안 공기 건조시킵니다. 다음으로, ECM의 상단에서 매체를 버리고 50 마이크로리터의 차가운 1x PBS를 얼음 위의 15-웰 슬라이드의 각 웰에 첨가한다.
대형 보어 피펫 팁 200 마이크로 리터를 사용하여 세 번에서 다섯 번 위아래로 피펫하십시오. 용액을 8웰 챔버 슬라이드의 웰 중앙에 분배합니다. 미세한 팁 피펫으로 웰에서 즉시 과도한 액체를 제거하십시오.
이어서, 챔버 슬라이드를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 40분 동안 두어 유리 바닥에 부착되는 오가노이드를 강화시킨다. 40분 후, 오가노이드를 1x PBS로 두 번 부드럽게 세척하고, 30분 동안 각 웰에 4% 파라포름알데히드 300 마이크로리터로 고정하여 실온으로 설정하였다. 1x PBS로 두 번 세척하고, 오르가노이드를 최대 2주 동안 면역염색을 위해 섭씨 4도 설정된 1x PBS에 저장한다.
조직학적 연구를 위한 오가노이드를 수확하기 위해, 배양물에서 배지를 제거하고 50 마이크로리터의 차가운 1x PBS를 얼음 위의 슬라이드의 각 웰에 첨가한다. 200 마이크로 리터의 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 세 번에서 다섯 번 위아래로 피펫을 만듭니다. 15웰 슬라이드 또는 배양 인서트의 모든 용액을 얼음 위의 15밀리리터 원뿔형 튜브에 결합합니다.
차가운 1x PBS를 추가하여 튜브의 총 용액 부피를 10 밀리리터로 조정하십시오. 튜브를 섭씨 네 도, 300 배 g에서 5 분 동안 원심분리하십시오. 그런 다음 상청액을 흡인하고 60 마이크로 리터의 따뜻한 히스토겔을 첨가하여 200 마이크로 리터의 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 오가노이드 펠렛과 혼합하십시오.
현탁액을 즉시 조직학 주형으로 옮깁니다. 실온에서 히스토겔을 응고시킨 후, 몰드 블록을 4% 파라포름알데히드에 넣어 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정시킨다. 소프트웨어를 열고 화면 하단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.
그런 다음 분석 컨트롤을 선택한 다음 자동 측정 결과를 선택합니다. 오가노이드 이미지를 열고 루멘이 보이는 5~10개의 오가노이드를 선택합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 메뉴를 열고 다각형 ROI를 선택하여 전체 오가노이드의 윤곽을 그려 오가노이드의 전체 표면적을 얻습니다.
그런 다음 루멘 영역을 얻기 위해 루멘을 윤곽을 그립니다. 웰 내의 나머지 오가노이드 및 분석의 모든 웰에 대해 이것을 반복한다. 마지막으로 데이터를 Excel로 내보냅니다.
루멘 면적을 전체 표면적으로 나누고 샘플의 모든 오가노이드를 평균하여 기준선 루멘 비율을 얻습니다. 밝은 필드 이미지는 성공적이고 실패한 샘플 컬렉션의 HNE를 나타냅니다. HNE는 큰 클러스터에서 잘 자랍니다.
대조적으로, HNEs는 조사된 3T3 세포를 둘러싸고 있는 두 개의 작은 클러스터에서 잘 성장하지 못한다. 15웰 슬라이드의 오가노이드는 배양 인서트의 오가노이드보다 더 정확하고 선명한 이미지를 가지고 있습니다. 이 외에도 이 두 가지 배양 방법에서 유의한 형태학적 차이는 관찰되지 않았다.
비 CF 오가노이드는 전형적으로 CF 오가노이드보다 더 큰 루멘과 더 많은 유체를 갖는다. 비 CF, F508del/F508del 피험자로부터의 오가노이드에서의 HNE 염색 및 오가노이드에서의 섬모의 면역형광 염색이 이들 이미지에 도시되어 있다. 아세틸화-튜불린, FITC 표지된 이차 항체, 및 DAPI로 표지된 핵으로 염색된 섬모를 여기에 나타내었다.
전체 탑재 면역형광 염색에 의한 두 개의 대표적인 오가노이드의 최대 프로젝션 이미지 및 이들의 상응하는 입체 재구성 이미지가 여기에 도시되어 있다. 오가노이드의 내강 내의 점액과 섬모가 표시됩니다. 그래픽 이미지는 일차 비강 상피 세포에서 CFTR 기능을 테스트하기 위한 포스콜린-유도 팽윤 검정을 나타낸다.
비 CF 자원자의 대표적인 포스콜린 용량-반응 실험이 여기에 제시되어 있다. FSK 용량-반응은 여덟 시간에 비해 한 시간에서의 평균 분획 변화와 비교되며, 이는 여덟 시간 분석이 한 시간에 있는 것보다 상이한 FSK 투여량들 사이에서 더 유의한 팽윤 차이를 생성할 수 있음을 시사한다. 곡선 아래의 영역은 여덟 시간에서의 평균 분수 변화와 비교하여 팽윤에서 약간의 차이를 나타낼 수 있다.
이 절차를 시도하는 동안 오가노이드는 수집, 고정 및 염색 과정에서 손실된다는 것을 명심하십시오. 따라서 각 단계에서 세심한주의를 기울여야하며 성공을 보장하기 위해 충분한 시작 번호를 얻어야합니다. 배양 인서트에서 성장하는 오가노이드는 이러한 기술이 개발됨에 따라 이와 관련하여 도움이 될 수 있습니다.
여기에서는 다른 조사자로의 확장을 용이하게하기 위해 상업적으로 이용 가능한 시약 및 공급품을 사용했습니다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석도 개발되었습니다.
