우리는 코 점막에서기도 줄기 세포의 수집을 설명합니다. 이 세포는 실험실에서 유사층화된 상피로 확장되고 분화됩니다. 이것은 시험관 내 확장 및 분화이며, 이는 생체 내기도와 유사하며, 이는 섬모 박동 빈도를 정량화하는 데 사용할 수있는 섬모 세포와 같은 특수 세포가 있음을 의미합니다.
서로 다른 개인과 다른 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 하기 위해 당사는 배양 조건과 이미지 획득을 표준화합니다. 섬모 박동 빈도 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 질병의 임상 도구로 사용됩니다. 우리는 이것을 낭포 성 섬유증의 임상 마커로 확립하기를 희망합니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사 과정 학생 인 Katelin Allan과 Laura Fawcett과 내 연구실의 박사후 연구원 인 Sharon Wong 박사입니다. 참가자에게 입으로 숨을 쉬도록 요청하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 주로 사용하는 손에 세포학 브러시를 잡고 참가자의 턱에 다섯 번째 숫자를 올려 손을 고정하고 세포학 브러시를 참가자의 비강에 참가자의 얼굴과 45도 각도로 삽입하고 비강 미트를 통과시킵니다.
브러시를 똑바로 회전시켜 참가자의 얼굴에 수직이되도록 한 후 브러시가 하부 비갑개의 중간에서 뒤쪽 부분이 될 때까지 하비갑개 아래 코의 측면 벽에 대해 브러시를 부드럽지만 단단히 전진시킵니다. 브러시를 360도 최대 3 번 돌립니다. 그런 다음 부드럽게 제거하고 삽입 조작을 반대로 하여 셀이 브러시에서 빠지지 않도록 합니다.
브러시를 비강 세포 수집 배지가 있는 준비된 수집 튜브에 넣고 수집 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 브러시에서 세포를 제거하기 위해 부드럽게 소용돌이 한 후 얼음 위의 수집 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다. 혈청 피펫을 사용하여 수집 튜브에서 새 튜브로 배지를 옮기고 세포학 브러시를 남깁니다.
그런 다음 샘플을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 1밀리리터의 조건부 재프로그래밍 세포 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 그런 다음 5 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브 위에 놓인 세포 체를 원형 운동으로 통과시킵니다.
단일 세포 현탁액을 얻으려면 튜브 바닥에서 현탁액을 수집하고 체를 여러 번 통과시킵니다. 그런 다음 셀 체를 폐기하십시오. 기도 상피 세포를 준비된 투과성 지지체 삽입물에 시드하려면 기포를 생성하지 않고 세포를 잘 혼합하여 균질하고 현탁 상태인지 확인합니다.
그런 다음 150 마이크로 리터의 세포 현탁액을 준비된 투과성 지지 삽입물의 정점 측에 추가합니다. 공기-액체 계면에서기도 상피 세포를 분화시키기 위해, 이들을 분화 또는 ALI 배지에서 2 일 동안 배양하십시오. 그런 다음 매체를 흡입하고 750마이크로리터의 ALI 배지를 기저 구획에만 추가하여 공기-액체 인터페이스를 만듭니다.
ECM 돔에기도 상피 세포를 시드하려면 해리 된기도 상피 세포를 적절한 부피의 90 % ECM으로 재현탁하십시오. 이어서 피펫을 웰의 바닥에 최대한 가깝게 90도 각도로 수직으로 잡고 50 마이크로리터의 ECM 세포 현탁액을 웰의 중앙에 분배한다. ECM이 굳을 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
ECM이 응고되는 동안 기도 오가노이드 파종 매체(AOSM)를 실온으로 따뜻하게 하여 재액화 및 추가 시 ECM 돔의 붕괴를 방지합니다. 배양 후, 우물의 벽을 분배하여 500 마이크로 리터의 온난 된 AOSM을 각 웰에 첨가하십시오. 미디어를 ECM 돔에 직접 피펫팅하지 마십시오.
4-7 일 동안 2 일마다 미디어를 교체하십시오. 미디어를 흡입하려면 플레이트를 45도 각도로 기울이고 ECM 돔에서 멀리 떨어진 우물의 하단 가장자리에서 흡인합니다. 4-7일 후, 500마이크로리터의 온난화된 기도 오가노이드 분화 배지(AODM)를 각 웰에 추가하여 오가노이드 분화를 시작하고 7일 동안 이틀마다 배지를 교체합니다.
기도 상피 세포 모델을 포함하는 배양 플레이트를 현미경 플레이트 삽입물에 넣고, 현미경 환경 챔버를 닫는다. 샘플이 예열된 섭씨 37도, 5%이산화탄소로 채워진 현미경 챔버에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 현미경 접안 렌즈에서 세포 모델에 초점을 맞 춥니 다.
그런 다음 획득 소프트웨어를 사용하여 L100을 클릭하여 광 경로를 카메라가 장착된 포트로 전환합니다. 녹색 재생 버튼을 클릭하여 소프트웨어를 통해 현미경 시야를 시각화합니다. 섬모에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.
메뉴에서 타임랩스 이미지를 가져오려면 획득을 클릭한 다음 빠른 타임랩스를 클릭합니다. 팝업 창에서 저장 위치와 파일 이름을 선택하고 1, 000 프레임을 획득하십시오. 현미경 시야에서 섬모를 미리 보려면 적용을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.
필요한 경우 Z 초점을 조정합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 빠른 타임랩스를 캡처합니다. 필요한 소프트웨어 및 도구 상자를 설치한 후 적절한 사용자 지정 분석 스크립트와 지원 스크립트 폴더를 컴퓨터의 로컬 드라이브에 복사합니다.
그런 다음 컴퓨팅 소프트웨어에서 홈 탭을 클릭 한 다음 경로 설정을 클릭하십시오. 팝업 창에서 하위 폴더와 함께 추가를 클릭합니다. MATLAB 검색 경로 아래에 표시된 폴더를 선택합니다.
그런 다음 저장 후 닫기를 클릭하십시오. 분석 스크립트가 왼쪽 패널에 나타나는지 확인하여 컴퓨팅 소프트웨어에 연결되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 획득한 예제 원시 이미지 파일을 컴퓨터의 로컬 드라이브로 전송합니다.
그런 다음 BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove 클릭하십시오. m 분석 스크립트 파일을 컴퓨팅 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 스크립트를 실행하려면 편집기 탭을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.
표시되는 프롬프트 창에서 분석할 원시 이미지 파일을 선택합니다. 프레임당 획득 시간에 대한 노출 시간을 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오. GetFirstAmplitude를 실행합니다.
m 스크립트를 AveSpectrum 파일이 포함된 폴더에 저장합니다. 스크립트가 FirstAmplitudeStacked를 출력할 때까지 기다립니다. XLSX 파일은 가장 높은 진폭 주파수를 포함하고기도 상피 섬모 박동의 생리적 범위 내에 있습니다.
FirstAmplitudeStacked에서 주파수 값을 복사합니다. XLSX 파일을 열고 과학 분석 소프트웨어를 사용하여 플롯합니다. 낭포성 섬유증이 있는 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 섬모 박동 빈도의 결과가 제시됩니다.
문화 분화 14 일째에는 섬모를 때리는 것이 존재했습니다. 배양 분화 21일째인 14일째부터, 섬모 박동 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 코호트 간에 관찰되지 않았다. 배양 분화 21일차에 건강한 대조군 참가자의 평균 섬모 박동 빈도는 낭포성 섬유증 참가자의 빈도보다 유의하게 높았습니다.
또한, 점액 제거 후 동일한 세포 모델에서 섬모 박동 빈도를 이미지화했을 때 건강한 개인과 낭포성 섬유증 환자 모두의 ALI 모델에서 점액을 제거했을 때 섬모 박동 빈도가 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 섬모 기능은 환경 요인의 변화에 매우 민감하기 때문에 이미징 환경을 엄격하게 규제해야합니다. 이 플랫폼은 CFTR 기능을 조절하는 약물을 식별 할 수 있도록 환자 별 약물 스크리닝을 위해 구축 될 가능성이 있습니다.
