Name: semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
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우리는이 연구의 그들의 지원을 위해 Boettcher 재단과 루 경화 증 협회 (#17-II-344)에 감사.

쥐와 관련 된 모든 절차는 콜로라도의 대학-Anschutz 의료 캠퍼스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (91813(05)1D).
 1. 주 1: 기본 (1 °)와 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 Immunostaining 마우스 hindlimb 근육 (예를 들어, 앞쪽에 tibialis, soleus)의 <ol><li>Air-dry 냉동된 섹션에 대 한 청구 슬라이드에 장착 ~ 30 분 11. 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하 여 섹션 주위에 테두리를 그립니다.</li>
	<li>장소 ~ 5 %BSA / 인산 염 버퍼 식 염 수 (BSA/PBS) 일반적인 항 체 바인딩 차단 하 각 슬라이드의 250 µ L. 1 헤에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어</li>
	<li>차단, 하는 동안 준비 1시 50분의 5%에서 표면에 뜨는 1 ° 항 체 희석 BSA/PBS (모든 마우스 단일 클론 항 체는; 표 1 6 , 12 참조); 250 µ L의 준비 슬라이드 당 솔루션입니다. 얼음에 1 ° 항 체 주식 및 희석 유지</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> 표 1: MyHCs를 구별 하는 데 사용 하는 기본 항 체.
<ol start="4"> <li>5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 열망에 따라 적절 한 슬라이드에 1 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 추가 250 µ L 5 %BSA / PBS 보조 (2 °) 항 체 전용 부정적인 제어 슬라이드.</li>
	<li>품 습 한 환경에서 24-48 h 4 ° C에서. 
	참고: 페 트리 접시 약화 필터 종이와 알루미늄 호 일에 커버 수 있습니다 역할을 적합 한 보육 실.</li>
</ol> 2. 주 2: 2 ° 형광 항 체와 Immunostaining <ol><li>1 ° 항 체 솔루션을 발음 하거나 5 %BSA / PBS 솔루션 제어. 워시 모든 슬라이드 3 번, 5 %BSA 10 분.</li>
	<li>세척, 동안 준비 1: 200의 5%에서 정화, fluorophore 활용 2 ° 항 체 희석 BSA/PBS (표 2 참조 하십시오 모두 염소 반대로 마우스). 슬라이드 당 솔루션의 250 µ L를 준비 합니다. 얼음에 어둠 속에서 2 ° fluorophore 활용 된 항 체를 유지</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> 표 2: Fluorophore 활용 된 이차 항 체 MyHCs 하는의 시각화 기본 항 체 인식 하는 데 사용.
<ol start="3"> <li>5 %BSA / PBS 차단 솔루션의 세 번째 응용 프로그램의 포부, 다음 모든 슬라이드에 2 ° 항 체 희석의 250 µ L을 추가. 어두운, 습 한 환경에서 실 온에서 90 분 동안 품 어.</li>
	<li>Aspirate 2 ° 항 체 솔루션입니다. 세척 모든 슬라이드 3 번, 10 분 5 %BSA / PBS.</li>
	<li>린스 PBS입니다. 10 분 동안 건조</li>
	<li>비 영구, 저 점도 수성 장착 매체 coverglass 탑재.</li>
	<li>건조 하면, 매니큐어와 슬라이드 가장자리 물개. 건조 하 고 어두운 slidebox에 저장.</li>
</ol> 3. Epifluorescence 현미경 검사 법으로 슬라이드 이미징 <ol><li>는 작은, 70% 에탄올 배어 연구소-삭제 기능으로 슬라이드를 청소.</li>
	<li>사진 장치 (재료의 표 참조)를 갖춘 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 immunostained 근육 섹션의 디지털 이미지를 얻기.
	<ol><li>약 1 m m 2 (10 X 목표, 1.4 나)의 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>보기는 505 통해 2 ° 알 렉 사 488 활용 된 항 체 형광 nm 긴 통과 필터. 595 nm 긴-패스 필터를 통해 2 ° 알 렉 사 594 활용 된 항 체의 흥분에 의해 생성 된 형광 볼. 호환 하는 이미징 소프트웨어를 갖춘 PC 컴퓨터와 이미지를 디지털화 합니다. 나중에 분석 소프트웨어 이미징에서 눈금 막대 포함.</li>
	</ol></li></ol> 4. 피지와 이미지의 분석 참고: 분석을 계속 하기 전에 https://imagej.net/Fiji/Downloads를 통해 피지 (는 건강의 국가 학회, 베 데스 다, 메릴랜드에서 자유롭게 사용 가능)를 설치 해야 합니다. 또한,이 과정에서 사용 하는 매크로 추가 파일에 제공 됩니다. 매크로 파일을 쉽게 액세스할 수 있는 디렉터리에 배치.
피지에서 선택한 섹션의 <ol><li>부하는 명시 이미지. 플러그인으로 이동 &#8594; 세분화 &#8594; Trainable Weka 세분화.</li>
	<li>섹션의 세포질 영역을 규정 하기 위해 라인에는 섬유, 그리고 클릭 &#34; 클래스 1에 추가 &#34;. 그런 다음, 섬유, 사이 공간에 선을 그릴을 클릭 &#34; 클래스 2에 추가 &#34; 세포 외 도메인을 표시. 각 클래스에 있는 5-10 레이블이 될 때까지 반복 합니다.
	<ol><li>클릭 기차 분류자입니다. 결과 빨간색과 초록색 오버레이에 추가 더 많은 레이블을 수동으로 (단계 4.2 참조) 이미지, 필요한 경우의 잘못 된 조각. 섬유 (레드) 섬유 (녹색) 사이의 공간에서 적절 하 게 분리 될 때까지 반복.</li>
	</ol></li> <li>클릭 &#34; 얻을 확률 &#34; 새로 레이블이 지정 된 폴더에 이미지를 저장 하 고.</li>
	<li>같은 필드에서 가져온 형광 이미지 (4.2-4.3 단계) 위의 절차를 반복 합니다. 으로 immunostained 섬유 라벨 &#34; 클래스 1 &#34;로 모든 비 형광 지역 &#34; 클래스 2 &#34;. 결과 확률 지도 처리 명시 이미지 저장 된 동일한 폴더에 저장.</li>
	<li>피지에서 이전에 저장 된 확률 지도 중 하나를 엽니다. 이미징 소프트웨어에 의해 제공 눈금 막대에 직선을 그립니다. 이동 분석 &#8594; 규모 설정. 눈금 막대에 의해 주어진 그들의 적절 한 값을 매개 변수 (즉, 알려진된 거리, 길이 단위)를 변경 후 확인은 &#34; 글로벌 &#34; 표준화 각 이미지에 대 한 규모를 상자.</li>
	<li>탐색 플러그인을 &#8594; 매크로 &#8594; 실행 &#8594; Tyagi 외. 섬유 부 량 macro.ijm (보조 파일 참조). 즉시, 탐색 창에 표시 됩니다. 이미지를 열고 &#39; s 호스트 폴더; 대화 상자가 표시 됩니다. 각 대화 상자에 대 한 변경 된 &#34; 배경 &#34; 드롭다운 값을 &#34; 빛. &#34; 참고: 폴더 이제 채워집니다 섬유 윤곽선의 이미지와 스프레드시트 소프트웨어 파일 (체코와 Feret 직경은 가장 관련 된 결과의 측정 섬유 형태; 측정 된 매개 변수를 조정할 수 있습니다 설정 측정 분석). 스프레드시트 소프트웨어 파일에 대 한 두 형광 및 밝은 분야 이미지 피지의 기 공 분석 기능에 의해 생성 하는 섬유 형태 데이터를 자동으로 옮겨질 것 이다.</li>
	<li>계산 하는 필드에 지정 된 MyHC 필드에 해당 필드 밝은 이미지에 총 섬유의 수에 의해 형광 섬유의 수를 분할 하 여 표현 하는 섬유의 분수.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

저자는 공개를 전혀 상반 되는 관심사를 있다.

여기, 우리 골격 근육 섬유 종류의 식별에 유용한 방향 제공. 이렇게, 우리는 데이터의 분석을 위한 새로운 알고리즘을 설명 합니다.
때문에 우리의 결과 크게 이전 보고서5,,810 의 확인 하 고 우리 자신의 수동 측정을 반영, 알고리즘은 정확 하 게 나타납니다. 아직도, 우리는 유물 단면에서 결과 불분명 섬?...

그것은 골격 근육 많은 종류1의 단일 섬유의 구성 된 시간에 대 한 알려져 있다. 처음, 섬유의 2 개 그룹 그들의 수축 성의 속성에 따라 특징 이었다 하 고, 적절 하 게, 느린-트 위치 (유형 I) 및 빠른 트 위치 (유형 II). 이러한 범주 추가 섬유 물질 대사에 바탕으로 구별 했다. 이후 유형 I 섬유는 미토 콘 드리 아에서 풍부 하 고 산화 물질 대사에 의존, 그들은 견고 하 게 긍정적인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-tetrazolium 환 원 효소 (NADH-TR) diaphorase2 또는 호박 효소 (SDH)3 에 의해 해명 되었다 얼룩. 대조적으로, 유형 II 섬유 전시 덜 NADH TR diaphorase 또는 SDH의 가변도 얼룩이 지 고 두 빠른 트 위치 하위 그룹으로 분할 되었다 (유형 IIA 및 IIB 입력) 그들의 상대적인 산화 용량에 따라 다소 조잡. 섬유 사이의 이러한 구분 myosin ATPase 얼룩에 의해 보다 효과적으로 시각화 되어 있다 어디 유형 I 섬유는 pH 4.0에서 사전 부 화 후 어두운 얼룩 및 유형 IIB 섬유 흡수 유형 IIA 섬유와 pH 10.0에서 촉진 다음 사전 부 화 4얼룩 판매인.
더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 유형5의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA를 입력 하 고 유형 IIB 섬유 확인 될 수 있다 모두 그들의 MyHC 프로 파일에 따라 정밀. 또한, 또 다른 빠른 트 위치-중급 metabolically 섬유 종류, IIX, 입력 되었습니다 확인된6. 하나 이상의 MyHC을 표현 하는 하이브리드 섬유도 확인된5,,78있다. 고양이 개 코 원숭이 등 일부 종 표현 유형 IIB MyHCs6하지 알려져 있습니다. MyHC immunostaining는 현재 근육 구성의-의 상태--예술 평가,이 기술을 통해 얻은 데이터의 분석은 복잡 하 고 자동화 된 도움 없이 소모. 이 위해 이러한 데이터를 분석 하는 반자동된 방법의 개발된5,,910되었습니다. 여기, 우리 소설 반자동된 함께 근육 섬유 타입5,,78,10, 의 immunohistochemical 식별에 대 한 상대적으로 표준 프로토콜 제시 섬유 유형 및 섬유 형태학의 분석 정확도와 가속 알고리즘입니다.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>L&#039;Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td><td></td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monclonal mouse IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>goat anti-mouse; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>goat anti-mouse;1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>goat anti-mouse;1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>cool with liguid nitrogen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, dilute to 1x</td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

수년간, 골격 근육 섬유 유형 사이 구분 했다 myosin ATPase 얼룩에 의해 최고의 시각 됩니다. 더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 타입의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA, IIX 입력 입력 하 고 유형 IIB 섬유는 정밀 프로필 기반으로 MyHC; 지금 확인 될 수 있다 그러나, 이러한 데이터의 수동 분석 느리고 다운 오른쪽 수 지루한. 이와 관련, 섬유 형 구성과 형태학의 신속, 정확한 평가 매우 바람직한 도구입니다. 여기, 우리는 최신의 immunohistochemical 마우스 hindlimb 근육 섬유 유형 및 섬유 형태 분석 가속 소설 반자동된 알고리즘으로 콘서트에서에서 얻은 냉동된 섹션에 MyHCs의 얼룩에 대 한 프로토콜을 제시. 표시 soleus 근육 유형 I에 얼룩이 지 고 입력 IIA 섬유, 예상 대로, 하지만 형식 IIX 또는 유형 IIB 섬유. 다른 한편으로, 앞쪽에 tibialis 근육 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유, 유형 IIA 섬유의 작은 일부분의 주로 구성 되었고 거의 또는 전혀 유형 I 섬유. 여러 이미지 변환 섬유 형태 (즉, 횡단면 지역 (CSA), 최대 및 최소 Feret 직경)의 다양 한 측면을 측정 하기 위해 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 값이 수동으로 얻은 다음 비교 했다에 대 한 얻은 값입니다. 체코, 최대 또는 최소 Feret 직경에 관하여 분석의 두 모드 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다 (모든 p &#62; 0.05), 우리의 방법의 정확도 나타내는. 따라서, 우리의 immunostaining 분석 프로토콜 노화와 myopathy의 많은 모델에서 근육 구성에 대 한 효과의 조사에 적용할 수 있습니다.

알 수 없는 나이의 남성 C57BL/6 마우스 해 부 Hindlimb 근육 (즉, 앞쪽에 tibialis, soleus) 액체 질소 냉각 isopentane 화합물 10 월에는 근육을 포함 하는 플라스틱 금형을 침 몰 하 여 냉동 플래시 했다. 그런 다음는 cryotome를 사용 하 여, 8-10 µ m 직렬 섹션-20 ° C에서 잘라 되었고 다른 긍정적으로 위탁 유리 슬라이드12전송.
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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K 조회수.  University of Colorado School of Medicine. 골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

절연 골격근의 묘 - 기계 분석

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

연구

의학

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

경 흉부 심 초음파에 의한 폐동맥 수축의 마우스 모델에서 마우스 오른쪽 심실 구조 및 기능의 평가

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

MyDoBID- 근육 섬유 유형을 효율적으로 식별하기 위한 새로운 기술

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot blotting, hereafter referred to as Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). This protocol describes the process of freeze-drying human skeletal muscle and isolating segments of single muscle fibers. Using MyDoBID, type I and II fibers are classified with MHCI- and IIa-specific antibodies, respectively. Classified fibers are then combined into fiber type-specific samples for each biopsy.
The total protein in each sample is determined by Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and UV-activated gel technology. The fiber type of samples is validated using western blotting. The importance of performing protein loading normalization to enhance target protein detection across multiple western blots is also described. The benefits of consolidating classified fibers into fiber type-specific samples compared to single-fiber western blots, include sample versatility, increased sample throughput, shorter time investment, and cost-saving measures, all while retaining valuable fiber type-specific information that is frequently overlooked using homogenized muscle samples. The purpose of the protocol is to achieve accurate and efficient identification of type I and type II fibers isolated from freeze-dried human skeletal muscle samples.
These individual fibers are subsequently combined to create type I and type II fiber type-specific samples. Furthermore, the protocol is extended to include the identification of type IIx fibers, using Actin as a marker for fibers that were negative for MHCI and MHCIIa, which are confirmed as IIx fibers by western blotting. Each fiber type-specific sample is then used to quantify the expression of various target proteins using western blotting techniques.

저자 스포트라이트: MyDoBID 기법을 사용한 골격근 섬유 유형의 미스터리 해독 

This protocol demonstrates single-fiber isolation from freeze-dried human skeletal muscle and fiber-type classification according to Myosin heavy chain (MHC) isoform using the dot blotting technique. Identified MHC I and II fiber samples can then be further analyzed for fiber type-specific differences in protein expression using western blotting.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

생화학

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

신경과학

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

생물학

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

광학 기반 시스템을 사용한 하이드로겔 내장 온전한 마우스 근육 섬유의 고처리량 수축 측정

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

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절연 골격근의 묘 - 기계 분석

Proteomics에서 골격근 성별 동종 이형

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인체 골격근의 섬유 유형 식별

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면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

마이 오신 중쇄 면역를 사용하여 쥐의 근육 크로스 섹션에서 근육 섬유 인구 분석을위한 신속한 자동화 프로토콜

광학 기반 시스템을 사용한 하이드로겔 내장 온전한 마우스 근육 섬유의 고처리량 수축 측정