우리의 프로토콜은 현재 사용중인 유일한 면역 적격 마우스 모델 인 GIST의 번식, 유지 보수, 해부 및 표본 처리를 설명합니다. 우리는 미래의 연구자들이 GIST에서 더 많은 번역 연구를 위해이 마우스 모델을 활용할 수 있기를 바랍니다. GIST의 전통적인 치료법은 티로신 키나제 억제제를 사용한 표적 분자 요법을 포함합니다.
이 모델을 통해 연구자들은 GIST에서 면역 요법을 테스트 할 수 있습니다. 시작하려면 모든 도구를 멸균하고 절차 전반에 걸쳐 장갑을 착용하고 멸균 된 필드를 유지하십시오. 70 % 에탄올로 절개 부위를 준비하십시오.
가위를 사용하여 두 센티미터의 중간 선 수직 절개를 만들고 복강에 들어갑니다. 복부 내 유착을 급격하게 용해시킵니다. 배수되는 장간막 림프절을 제거하려면 맹장을 확인하고 장간막을 우월하게 들어 올립니다.
결장 장간막의 기저부까지 대략 중간쯤에, 장간막 림프절을 확인하고 급격하게 해부하십시오. 필요에 따라 림프절 조직을 단백질 분리, 조직학 및 단일 세포 현탁액을 위해 삼분의 일로 나눕니다. 림프절 조직을 단일 세포 현탁액을 위해 RPMI 배지 20 밀리리터에 넣고 얼음 위에 보관하십시오.
맹장은 대부분 Kit558 마우스에서 GIST로 대체됩니다. GIST와 맹장의 분리를 위해, 조심스럽게 종양의 기저부에서 ileocolic 접합부를 나눕니다. 그런 다음 맹장을 다시 나누고, 종양의 기저부에 두 센티미터 원위입니다.
Kit558 마우스의 50 ~ 60 %에서 종양의 머리에는 일반적으로 장액이 포함되어 있지만 고름이 거의 포함되지 않는 맹장 조직의 캡이 포함되어 있습니다. 뚜껑 조직을 종양 조직에서 급격하게 해부합니다. 종양 조직과 맹장을 단백질 분리, 조직학 및 단일 세포 현탁액을 위해 삼분의 일로 나눕니다.
단일 세포 현탁액의 경우, 종양 조직 또는 맹장을 2 % FCS로 HBSS에 넣고 샘플을 덮을 수있을만큼 충분히 얼음 위에 보관하십시오. RPMI 배지를 림프절 표본과 함께 100마이크로미터 필터 위에 붓습니다. 필터를 새로운 50 밀리리터 원뿔형으로 옮기고 3 밀리리터 플라스틱 주사기의 부드러운 끝으로 림프절을 매시하십시오.
20 밀리리터의 RPMI 매체로 필터를 세척하십시오. 샘플을 원심분리하고 상청액을 흡인한다. 펠렛을 20 밀리리터의 비드 버퍼에 재현탁하고 40 마이크로 미터 필터 위에 붓습니다.
세포 여액을 수집한다. 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 샘플을 원심분리하고 상청액을 버린다.
이어서, 유세포 분석을 위해 비드 완충액에 재현탁시킨다. 텍스트 원고에 기재된 대로 콜라게나제 완충액을 준비한다. GIST를 멸균 접시에 넣고 콜라게나제 버퍼 2.5 밀리리터를 넣으십시오.
멸균 메스와 가위를 사용하여 종양이 미세 조각이 될 때까지 종양을 다듬습니다. 큰 보어 피펫을 사용하여 종양과 콜라게나제를 50 밀리리터 튜브로 흡인하십시오. 섭씨 37도에서 분당 100회 회전으로 30분 동안 배양한 다음, 두 밀리리터의 FBS로 반응을 냉각시킨다.
GIST 표본으로 콜라게나제를 100마이크로미터 필터에 붓고 3밀리리터 플라스틱 주사기의 부드러운 끝으로 종양을 매시하고 50밀리리터 튜브에 모으십시오. 20 밀리리터의 HBSS로 필터를 세척하십시오. 여액을 섭씨 4도에서 5분 동안 450 RCF에서 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.
펠렛을 20 밀리리터의 비드 버퍼에 재현탁시키고 40 마이크로미터 필터에 부어 여액을 수집하고 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수한다. 원심분리하고, 상청액을 흡인한 다음, 유세포 분석을 위해 비드 완충액에 재현탁시킨다. 가위를 사용하여 맹장을 세로로 분할하여 내부 점막을 노출시킵니다.
0.5 센티미터 섹션으로 자르고 HBSS 5 밀리리터와 2 % FBS가있는 50 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 30초 동안 격렬하게 흔들고 450 RCF에서 20초 동안 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리십시오.
2 밀리몰 EDTA로 HBSS를 다섯 ~ 20 밀리리터에 첨가하십시오. 섭씨 37도에서 분당 100회 회전으로 15분 동안 배양한다. 원심분리하고, 상청액을 버리고, 펠렛을 HBSS의 다섯 내지 20 밀리리터에 재현탁시킨다.
혼합물을 30초 동안 격렬하게 진탕한 다음, 450 RCF에서 20초 동안 원심분리하고 상청액을 버린다. 이 과정을 한 번 더 반복하십시오. 펠렛을 5 밀리리터의 콜라게나제 완충액에 재현탁시킨 다음, 섭씨 37도에서 분당 100회 회전으로 30분 동안 인큐베이션한다.
10 분마다 격렬하게 흔들고 두 밀리리터의 FBS로 반응을 진정시킵니다. 맹장 표본으로 콜라게나제를 100마이크로미터 필터에 붓고 3밀리리터 플라스틱 주사기의 부드러운 끝으로 매쉬합니다. 20 밀리리터의 HBSS로 필터를 세척하고 여과액을 수집하십시오.
원심분리하여 상층액을 버린다. 펠렛을 20 밀리리터의 비드 버퍼에 재현탁하고 40 마이크로 미터 필터 위에 붓습니다. 여액을 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오.
원심분리 과정을 한 번 더 반복하고, 펠렛을 유세포 분석을 위해 비드 완충액에 재현탁시킨다. Kit558 마우스는 진행성 장 폐쇄로 인해 8개월의 평균 수명을 가졌다. Kit558 마우스로부터의 종양은 티로신 키나제 KIT, 막횡단 채널 Dog1, 및 전사 인자 ETV1을 포함하는 GIST의 정준 마커를 발현하였다.
종양은 인간 GIST를 밀접하게 모방한 하류 마커 ERK 및 AKT 또는 면역 미세환경과 같은 KIT 신호전달 경로의 변화에 대해 연구되었다. MRI 또는 CT는 종양 반응의 정확한 측정으로서 종양 용적을 추적하기 위해 사용되었다. 종양을 장폐색 접합부로부터 멀리 떨어져 있고 맹장 뚜껑으로부터 멀리 해부하는 것은 진정한 종양 중량 및 면역 및 분자 분석을 포착하는 데 중요하다.
GIST에서, 이 모델은 면역요법뿐만 아니라 종양 미세환경의 조사를 허용하였다.
